人抗菌肽LL-37的原核表达及其抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染活性的初步研究

摘要

LL-37是人体内发现的抗菌肽Cathelicidin家族的唯一成员,由37个氨基酸残基组成,因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)而得名。LL-37抗菌谱广,体外研究显示对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒均发挥抑制作用,特别是对部分临床耐药菌及临床易感菌株也有较强的抑菌活性,因此有很好的应用前景。本文采用原核表达系统实现小分子抗菌多肽LL-37的可溶表达,并研究其在皮肤创伤感染中发挥的活性作用。本课题将LL-37连接入pET32a载体中进行可溶表达,通过考察表达诱导因素获得高产量的LL-37,体外实验验证其抗菌活性,最后研究LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤创面耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的预防治疗作用,并从抗细菌生物膜方面探讨其作用机制。
　　研究目的:
　　本文主要是采用pET32a表达载体实现LL-37的可溶表达,同时还探讨了LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)创伤感染模型的预防治疗作用,并对其机制进行初步研究,为小分子抗菌肽的基因工程表达提供参考,也为LL-37的深入研究和开发应用提供实验依据。
　　研究方法:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37的生物信息学分析及表达载体构建:运用相关生物信息学软件对融合蛋白Trx-LL-37氨基酸序列进行分析预测,初步了解融合蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构以及可溶表达概率。参考GenBank中已发表的LL-37全长cDNA基因序列(No.:CAA46115)以及 pET32a(+)多克隆位点序列,设计两条特异性引物,PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入KpnⅠ、SacⅠ酶切位点以及甲酸裂解位点。通过KpnⅠ、SacⅠ双酶切反应,将含有LL-37的小片段连接入pET32a表达载体中,进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定。
　　2.LL-37的原核表达、纯化及鉴定:将构建好的表达载体pET32a-LL-37转化入BL21(DE3)中进行表达,采用SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物进行鉴定。以融合蛋白Trx-LL-37的可溶蛋白表达水平为指标,通过诱导条件及表达条件的单因素优化,确定最佳表达参数。通过Ni2+亲和层析色谱法纯化融合蛋白Trx-LL-37,甲酸裂解去除标签蛋白,再次采用Ni2+亲和层析色谱法纯化目标蛋白LL-37。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究:选取金黄色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌S.epidermidis、大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等临床常见感染菌种作为实验对象,采用琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法,验证纯化产物LL-37的抑菌活性。建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型,以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照,通过统计分析体重变化、组织菌负荷、感染愈合时间、创面愈合率等指标探讨了LL-37的治疗效果。
　　4.LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:采过96孔板法,以金黄色葡萄球菌作为阳性菌对照,探讨了MRSA的体外成膜能力。然后结合激光共聚焦实验研究了LL-37对MRSA生物膜形成的影响以及对已形成的MRSA生物膜的破坏作用。
　　结果:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37生物信息学分析及表达载体构建:经过生物信息学软件预测分析,融合蛋白Trx-LL-37基因编码蛋白含有195个氨基酸,分子量为21.5kDa,理论等电点为6.3,热稳定性好、半衰期长,属于稳定类蛋白;融合蛋白二级结构简单,主要包含α-螺旋、无规则卷曲;根据两个参数模型预测显示,重组融合蛋白具有可溶性表达的倾向,可采用基因工程技术进行表达。特异性引物PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入特异性酶切位点以及甲酸裂解位点。经KpnⅠ、SacⅠ双酶切后连接入pET32a表达载体,进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定,片段大小以及氨基酸序列均与GeneBank公布一致。
　　2.LL-37的原核表达、纯化及鉴定:构建的表达菌BL21(DE3)/pET32a-LL-37经诱导表达,SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物鉴定结果显示,IPTG诱导后的菌体蛋白在21.5kDa附近存在目标蛋白(Trx-LL-37)条带,而未诱导的未出现相应大小的条带。诱导表达条件经过优化,种子菌180rpm37℃培养2.5h,加入终浓度0.05mMIPTG,于17℃低温诱导,培养24h,此时融合蛋白Trx-LL-37表达量最高,重组蛋白在总可溶蛋白中的比例也最高,达到45％以上。融合蛋白Trx-LL-37经Ni2+亲和层析色谱法一次纯化,甲酸裂解去除标签蛋白,Ni2+亲和层析色谱法二次纯化,最终获得目标蛋白LL-37。终产量为每升发酵液得到目标蛋白LL-37约3mg。经RP-HPLC色谱分析,峰面积结果显示,目标蛋白纯度在90%以上。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究:琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法实验结果显示,产物 LL-37对于临床常见感染菌种具有抑菌活性,并且其 MICs以及 MBCs与经典文献一致。本实验建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型,观察 LL-37对创面感染的影响,以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照,进行比较。每日观察发现,治疗组小鼠精神状态正常,进食、休息等活动均未受到影响,体重正常增长;生理盐水组小鼠精神萎靡,毛发无光泽,体重水平一直处于治疗组小鼠之下。具体结果显示, LL-37组第3d创面即干燥结痂,痂下湿润,渗出物相比对照组明显减少,局部组织菌负荷比对照组低了约3.5-Log(CEU/gtissue),差异有统计学意义(P<0.05),说明LL-37有效降低了局部组织菌负荷,能够及时抑制早期烫伤创面细菌的定植与增长,预防控制感染的发展。第9d,LL-37组创面明显缩小,痂下肉芽组织生长迅速,愈合率与庆大霉素组无统计学差异(P>0.05)。9dHE病理切片还发现,生理盐水组创面正下方皮下组织分布有脓细胞碎片,可见炎症细胞浸润,而治疗组均无;除此,LL-37皮下出现大量成纤维母细胞及新生血管,修复状况明显优于对照组。从另一方面说明,LL-37对模型小鼠烫伤创面具有促愈合修复作用。综上, LL-37对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创伤模型具有一定效果。
　　4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:96孔板法联合结晶紫染色结果显示,MRSA与阳性质控菌株S.aureus(ATCC25923)相比,两者成膜能力相当,在统计学意义上无显著差异(P>0.05)。然后,本实验选取6.25、3.13、0.625、0.0625μM4个亚抑菌浓度,研究LL-37对于MRSA体外生物膜形成的影响,发现LL-37不仅作用于生物膜形成的初始阶段——细菌的附着,还对已成型的生物膜具有杀伤破坏作用。结果显示,LL-37在1/20MIC浓度对生物膜形成的抑制作用即有统计学意义,1/4 MIC3.13μM条件下对生物膜形成的抑制率达63%;在激光共聚焦显微镜下可观察到,1/4MICLL-37作用48h后,MRSA生物膜内组成细菌数目明显减少,成形的菌斑结构疏松,无信号区居多,生物膜较薄,平均厚度仅为未加药组的1/4。
　　结论:
　　本研究通过原核系统可溶表达得到融合蛋白Trx-LL-37;融合蛋白经甲酸裂解、两步Ni柱纯化获得目标蛋白LL-37,体外抑菌试验证明其具有抑菌活性。通过对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创面治疗发现,LL-37能够抑制感染创面细菌的定植与生长,预防感染,促进创面愈合。体外96孔板法研究显示,MRSA具有强大的生物膜形成能力;LL-37具有抗生物膜活性,在1/20MIC亚抑菌浓度条件下,即可抑制MRSA生物膜的形成,且有统计学意义。细菌生物膜的形成是许多慢性感染创面延迟不愈的主要原因,也是许多细菌产生耐药性的原因,LL-37不仅预防控制MRSA感染,还能抑制MRSA生物膜的形成,由此表明,LL-37对于耐药菌造成的感染具有一定的效果。

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中文摘要

英文摘要

第一章 序 言

1.1 研究背景

1.2研究路线

第二章 融合蛋白Trx-LL-37生物信息学分析及表达载体构建

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 LL-37的原核表达、纯化及鉴定

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染活性的初步研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

全文总结

研究展望

参考文献

攻读学位期间科研情况及所受奖励

附录1 英文缩写语中文对照

附录2 载体图谱

附录3 测序图

文献综述

致谢