肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7 tccP基因缺失菌株的构建及其生物学性状的研究

摘要

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC)O157:H7(本文简称O157)是一种重要的人畜共患传染病病原菌。自1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，还可在5~10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。 O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。同时，O157:H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。美国疾病预防控制中心(CDC)已将EHEC0157:H7菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。 细菌和宿主的相互作用是决定感染的关键。EHEC O157: H7定植在肠粘膜处并能产生特有的“黏附和擦拭”(attaching and effacing，A/E)损伤，是通过其III型分泌系统与宿主细胞相互作用所致。EHEC O157: H7通过III型分泌系统将Tir(translocatedintinun receptor，Tir)转运至宿主细胞，Tir与intimin结合后通过Tir-细胞骨架偶联蛋白(Tir-cytoskeleton coupling protein，TccP)介导肌动蛋白聚集。 肌动蛋白聚集，形成粘附底座(pedestal formation)是A/E损伤形成的必要条件。现有实验已证明，由23072基因所编码的TccP蛋白为EHEC引起的肌动蛋白踏板形成所必需。TccP是EHEC O157: H7转移至宿主细胞的效应分子中与宿主细胞分子相互作用的终端效应分子，在O157: H7造成A/E损伤过程中发挥重要作用。为了研究TccP在致A/E损伤中的作用，阐明O157: H7的致病机理，本研究采用同源重组技术构建了EHEC O157: H7 tccP基因缺失菌株并对其生物学性状进行了研究。 本实验完成了以下几个方面的工作： 1、EHEC O157:H7 tccP基因打靶载体的构建。 1.1根据GenBank公布的肠出血性大肠埃希菌0157:H7(Saka/株)基因序列，设计PCR引物，分别扩增肠出血性大肠杆菌0157:H7(Saka/株)tccP基因两端各1292bp和1038bp大小的核酸片段以及氯霉素抗性基因片段，并分别克隆于pMD-18T。 1.2右侧同源臂(RA)克隆入pBlueScript SK(-)质粒获得载体质粒pBlueScriptSK(-)-RA。 1.3氯霉素抗性基因(Cam)克隆入载体质粒pBlueScript SK(-)-RA而从获得载体质粒pBlueScript SK(-)-Cam-RA。 1.4左侧同源臂(LA)克隆入载体质粒pBlueScript SK(-)-Cam-RA从而获得用于基因敲除的打靶载体质粒pBlueScript SK(-)-LA-Cam-RA，含有左、右侧同源臂以及筛选抗性基因的DNA片段。 2、采用同源重组技术对EHEC O157:H7 tccP基因成功进行了敲除。 2.1 BamHI、Kpnl双酶切从打靶基因载体质粒上获得用于打靶的LA-Cam-RA片段，利用电转化将其转入EHEC O157:H7，利用氯霉素抗性筛选并挑取阳性克隆。 2.2提取细菌基因组，PCR分别扩增tccP、LA+Cam、Cam+RA片段，结果不能扩增出tccP基因，而能够扩增出LA+Cam和Cam+RA片段，证实了tccP基因的缺失。 2.3提取细菌的总RNA，进行RT-PCR，分别扩增tccP基因和内参基因gyrB，结果能够扩增出内参基因gyrB而不能扩增出tccP基因。 2.4全菌蛋白进行SDS-PAGE后，以TccP抗体作一抗，进行Western blot试验，结果tccP基因缺失菌株蛋白不能与TccP抗体血清发生反应。 3、△tccP EHEC O157:H7的生物学性状研究。 3.1细菌与HeLa细胞的黏附试验结果显示△tccP EHEC O157:H7不能与HeLa细胞呈聚集性黏附。 3.2 FAS试验结果显示△tccP EHEC O157:H7不能引起肌动蛋白聚集。 3.3细菌感染Balb/c小鼠试验结果显示△ tccP EHEC0157:H7感染不能导致小鼠死亡。 综上所述，本研究构建了EHEC O157: H7 tccP基因缺失菌株，从DNA、RNA以及蛋白质水平证实了基因缺失菌株的构建是成功的，并且利用细菌与HeLa细胞的黏附试验、FAS试验及动物感染试验对tccP基因缺失菌株的生物学性状进行了研究。EHEC O157: H7 tccP基因缺失菌株的构建为研究O157: H7的致病机理提供了重要的研究工具和手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

前 言

第一部份 肠出血性大肠杆菌O157：H7 tccP基因敲除打靶载体的构建

实验材料

实验方法

实验结果

第二部分 采用同源重组技术敲除tccP基因并对基因缺失菌株进行鉴定

实验材料

实验方法

实验结果

第三部分 EHEC O157：H7 tccP基因缺失菌株的生物学性状研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 肠出血性大肠杆菌O157：H7 TccP蛋白研究进展

在读期间取得的成果及发表的文章