人肝细胞膜蛋白MRP3(ABCC3)在阻塞性胆汁淤积肝组织中表达变化及其调节机制

摘要

背景与目的：肝脏是胆酸合成、分泌、胆汁形成及其再循环(肠肝循环)的重要器官。胆汁淤积是指胆汁的生成和/或胆汁内溶质排出障碍，一些正常从胆汁中排泄的物质如胆酸、胆红素和胆固醇在血液内异常堆积[1，2]。而胆酸、胆红素等物质的排泄则主要靠肝细胞膜上的胆酸转运蛋白系统，它们包括MRPs、OATPs、NTCP、Bsep等等[3]。其中，MRPs(multidrug resistance-assocated proteins)家族，是一类非常重要的有机阴离子转运蛋白，属于ABC转运体超家族，目前已知至少有9种(MRP1-9)。主要分布于肝脏、肾脏、肠道等器官组织。MRPs的分子结构基本都包含跨膜区(TMD)与核苷酸结合域(NBD)。它们的主要功能是转运葡萄糖醛酸结合物、GSH、硫酸盐、或某些抗癌药物等等[4]。 多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-assocated protein3，MRP3)是近年新克隆的一种转运蛋白基因，主要分布于肠道、肾脏及肾上腺，而在正常肝细胞基底侧膜上表达很低或不表达[5]。但是在胆道结扎所致的急性胆汁淤积大鼠模型的肝脏中MRP3的表达量却非常高[6]。同时进一步研究发现在人类胆汁淤积性疾病(如：胆道梗阻、原发性毛细胆管性肝硬化、Dubin-Johnson综合征)时，MRP3在肝细胞基底侧膜表达量也大为增加，而同时肝细胞小管面的MRP2的表达量却急剧下降[7]。随着对MRP3转运功能研究进一步的深入，发现其转运底物与MRP2具有广泛的同源性，都能转运大部分胆酸，尤其是结合型胆酸，因此，MRP3的高表达被认为是代偿性的，以补偿小管面膜上MRP2的下调。所以，人们普遍认为MRP3的表达增高是在胆汁淤积状态下肝细胞的一种代偿性自我保护反应[6，8]。因此，随着对MRP3调节的分子机制的进一步研究深入，有可能在不久的将来开发出治疗胆汁淤积疾病的特效药物，并且对临床寻找肝胆汁淤积治疗对策也具重要的临床价值。 当胆汁淤积发生时，肝脏MRP3基因mRNA转录表达与核受体CPF，RXRa、RARα、Sp1，PXR等基因相关。已经有文献报道，在体外细胞培养与胆道结扎的动物模型实验研究表明，核受体CPF/Lrh-1能够上调MRP3/Mrp3 mRNA的表达[6]； RXRα：RARα异二聚体则能够抑制MRP3的表达[9]。Spl，PXR等也对MRP3的基因表达起一定的调节作用[10]，但是其具体机制尚不清楚。而且目前的实验研究主要集中在体外细胞培养和动物模型实验，直接针对以“人”为研究对象的实验鲜有报道，人体组织的研究结果与体外细胞培养或动物实验常存在差异，如：用内毒素处理的大鼠Mrp2mRNA的表达水平急剧下降，而当以“人”为研究对象时MRP2 mRNA的表达水平却维持不变，但是二者Mrp2/MRP2蛋白水平的变化却均急剧降低[11]。本实验通过收集40例人体肝组织标本，对阻塞性胆汁淤积时MRP3上调相关的基因进行研究，从而进一步探讨与研究阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3的转录调控机制。 方法: 通过对收集的40例标本分组(对照组：正常肝组织；淤胆组：淤胆肝组织)后，分别在mRNA水平(RT-PCR)与蛋白水平(Western blot)检测分析膜转运蛋白MRP3表达变化，以及与其调节相关核受体基因CPF. RXRα与RARα表达变化。通过免疫荧光检测膜转运蛋白MRP3与核受体CPF在正常肝与淤胆肝组织的表达以及定位情况。通过EMSA来检测MRP3基因启动子区反应元件与核受体CPF结合活性在正常肝与淤胆肝组织的变化。 结果: 1.阻塞性胆汁淤积时，通过RT-PCR实验研究对膜转运蛋白基因MRP3与核受体基因CPF，RXRα、RARα等在mRNA水平表达进行分析，结果表明：MRP3以及上述基因在mRNA水平表达均显著增高，增高约3~4倍左右。 2.免疫荧光检测结果表明，阻塞性胆汁淤积时，膜转运蛋白MRP3在肝细胞基底侧膜的表达明显增加。而CPF的表达，在核内与胞浆内均有增加。 3.人肝脏阻塞性胆汁淤积时，通过Western blot实验对膜转运蛋白基因MRP3与核受体基因CPF、RXRα、RARα等在蛋白水平表达进行分析，结果表明： MRP3蛋白水平表达增高约4倍。CPF、RXRα、RARα在核内表达增高约6~8倍；而在胞浆内，RARa显著增高约13倍；RXRα增高约2，5倍，CPF增高约4倍。 4.人肝脏阻塞性胆汁淤积时，通过EMSA检测结果表明：MRP3基因启动子区反应元件与核受体CPF结合活性显著增加，约3.5倍。 讨论: MRP3(ABCC3)在正常肝细胞膜低表达或不表达。而当胆汁淤积发生时，肝细胞基底侧膜的MRP3表达却显著增高。同时，又由于MRP3转运底物与MRP2有着广泛的同源性，所以人们普遍认为MRP3的高表达是对MRP2的一种代偿，以减轻胆汁淤积时肝细胞受胆酸毒性损伤的程度，具有护肝的作用。因此，对MRP3表达调节的分子机制的研究，对寻找胆汁淤积治疗对策有着非常重要的临床意义。 本实验通过对人体肝组织标本研究分析得知，阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3在肝细胞基底侧膜的表达量显著增高。MRP3基因启动子区反应元件与核受体CPF结合活性显著增高，这些充分证明核受体CPF能够上调人肝细胞膜转运蛋白MRP3基因的转录表达功能。这与先前相关文献报道的体外细胞培养以及胆道结扎的胆汁淤积动物模型的实验结果相一致[5，6，7，8，9]。而核受体RXRα、RARα不论是在mRNA水平还是蛋白水平均显著增高，这与文献报道的体外细胞培养以及胆道结扎的胆汁淤积动物模型的实验结果结果相反[9]。尤其值得注意的是，核受体蛋白RARa在胞浆内的表达增高约13倍，而在核内增高约6倍，这与RXRα、CPF在核内以及胞浆的表达增高的情况相反。这可能提示RARα进入细胞核后，在某些因素的作用下，引起它由细胞核内向胞浆转移的核外转移现象，这需要进一步的研究证实。以上实验结果充分说明了人肝脏MRP3调节的分子机制与胆道结扎动物模型或体外细胞培养实验所建立的调节机制存在某些差异。另外，核受体蛋白RXRα、RARα、CPF在胞浆与核内的分布可能还存在差异，这可能提示其他的调节机制也参与了MRP3基因转录表达。 结论: 通过本实验研究，我们证实了人肝脏阻塞性胆汁淤积时核受体CPF对MRP3基因转录表达具有上调的功能。核受体RXRα、RARα在胆汁淤积时表达显著增高，这与相关文献报道的胆道结扎动物模型或体外细胞培养的实验结果不同，这可能提示其他的调节机制也参与了MRP3基因的转录表达，有待进一步深入研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分人体肝组织标本的收集、分类与临床资料

材料与方法

临床资料

第二部分阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3基因及相关核受体CPF、RXRα、RARα基因mRNA表达变化

材料与方法

结 果

材料与方法

实验结果

讨 论

第三部分阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3与核受体CPF蛋白免疫荧光分析

材料与方法

实验结果

讨 论

第四部分阻塞性胆汁淤积时人肝细胞膜转运蛋白MRP3与核受体CPF、RXRα、RARα蛋白表达的免疫印迹分析

材料与方法

实验结果

讨 论

第五部分阻塞性胆汁淤积时人肝脏MRP3基因启动子区反应元件与核受体CPF结合活性变化

材料与方法

实验结果

讨 论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述:膜转运蛋白MRP3的结构、分布与功能研究现状

硕士研究生期间主要发表论文