甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的药代动力学与临床疗效相关性研究

摘要

目的：甲氨蝶呤是临床治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的最为常用的改变病情抗风湿药。常用的给药剂量及给药方法为：5—25mg，1次/周，口服。给药后4-8周才开始出现临床改善。目前调整给药剂量(5-25mg 范围内)完全依赖医师的临床经验，无明确药代动力学理论指导。依据目前给药方法，也无法达到稳态血药浓度。
　　 给药剂量不足，作用时间短暂，都可能导致治疗药物达不到有效治疗目的，而延误病情。近年来，研究发现甲氨蝶呤存在细胞内代谢，细胞内代谢物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate, MTXPG)可蓄积长达1月甚至数月。这提示细胞内代谢物可能与小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的疗效有关，但尚未证实。本实验以临床治疗中的患者为对象，研究口服常用剂量7.5mg时，甲氨蝶呤单剂量药代动力学特点，为临床调整给药剂量提供药代动力学理论依据。并监测了服用常用剂量7.5mg 多剂量时，不同患者血红细胞内MTXPG的含量变化，初步探讨血红细胞内MTXPG的量与临床疗效的相关性，从而进一步为临床调整甲氨蝶呤给药剂量和给药方法提供可行的依据。
　　 材料和方法：实验分为四部分：1、建立小剂量7.5mg 剂量时检测血药浓度方法。
　　 采用甲氨蝶呤标准品(100mg/支，纯度99.6％，批号100138-200603)，制备生物样品标准溶液经沉淀蛋白、提纯、萃取后，采用柱前衍生化，反相高效液相色谱(reversed-phasehigh-performance liquid chromatography, RP-HPLC)分离，荧光检测器监测，制备人血浆浓度标准曲线，建立微量血样检测低浓度(ng/ml)甲氨蝶呤的实验方法。2、考察RA患者7.5mg 单剂量药代动力学特点。依据明确的纳入标准、排除标准选取RA患者4名，入组患者年龄、体重、身高均无明显差异。受试者于服药前抽取空白血样并安置留置针，空腹口服7.5mg 甲氨蝶呤后，分别于服药后第0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12,24,48小时取血3ml 置肝素钠抗凝试管，离心并分离血浆，储存于—20℃冰箱待分析。采用已建立的反相高效液相色谱分析法检测各时相点血药浓度，以中国药理学会编制的药物统计软件(Drug and statistics，DAS)1.0药代动力学计算程序，处理血药浓度经时变化数据，进行室模型拟合，计算出0-12小时药代动力学参数。并结合本实验0-12小时药时曲线下面积，用线性梯形法进行小剂量甲氨蝶呤有限采样法方案探讨。3、建立人血红细胞内MTXPG 药物浓度检测方法。采用多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX-GLU4)标准对照品，制备生物样品标准溶液经水解转换反应后，经过沉淀蛋白、提纯、萃取，采用高效液相色谱分离后，经库仑电化学仪进行氧化衍生化反应，荧光检测器监测，制备人血红细胞内MTXPG浓度标准曲线，建立微量血样低浓度(ng/ml)MTXPG的检测方法。
　　 4、MTXPG的药代动力学与临床疗效的相关性研究。依据纳入标准、排除标准选取RA患者，每周1次口服甲氨蝶呤7.5mg，于第1次服药后72小时、第1周、第4周、第8周、第12周为时间点采集血样。肘静脉取血3ml, 加入肝素抗凝的干燥试管。血样离心后，分离血红细胞并存于-20℃直到HPLC分析。绘制药时曲线，观察MTXPG的药代动力学特点。同时取服药8周的患者进行疗效评价，观察受试患者血红细胞中MTXPG浓度与肿胀关节数、压痛关节数、疼痛指数、血沉、日常生活能力等疗效指标相关性。
　　 结果：1、在选定的色谱条件下，测得甲氨蝶呤色谱图被测物峰形良好，无杂质峰干扰，甲氨蝶呤的保留时间为3min；甲氨蝶呤标准曲线方程为Y=3631.33X+43964.2，R=0.998。在250～6.25ng·mL-1范围内线性关系良好。当信噪比≥2(s/n ≥2)时，血浆最低检出浓度为5 ng·mL-1，符合实验要求。2、单剂量7.5mg 给药，体内过程符合一室模型，以一室模型计算药代动力学参数，血浆半衰期约为3小时，受试者达峰浓度时间均不相同，约为1—2小时，达峰浓度、药时曲线下面积(area under the curve, AUC)个体间存在很大差异。依据实验中0-12小时药时曲线下面积用线性梯形法估算，服药后1、2、6、12时间点血浆浓度相对于时间曲线下的面积，能够较好地预测服药后0—12小时药时曲线下的面积。3、在选定的实验条件下，测得多聚谷氨酸化甲氨蝶呤色谱图被测物峰形良好，分离完全，被测物保留时间为7 min；标准曲线方程为Y=9.3317X+0.0987，R=0.999。在20～2.5ng·mL-1范围内线性关系良好。当信噪比≥2(s/n ≥2)时，最低检出浓度为1.2 ng·mL-1。4、服药后72小时，在人血红细胞中检测到MTXPG；
　　 随着每周1次规律服药，人血红细胞中的MTXPG 逐月增加。MTXPG 含量较高患者疗效评定均达美国风湿病协会疗效评定为20％标准ACR-20(the American College ofRheumatology Criteria, ACR)。MTXPG的含量较高与较少的压痛关节数、较少的肿胀关节数、较低的疼痛指数相关。
　　 结论：
　　 1、本实验建立的微量血样检测低浓度甲氨蝶呤血药浓度方法特异性强，灵敏度高，线性范围广，简便准确，可作为检测小剂量甲氨蝶呤血药浓度的常规方法。2、甲氨蝶呤血浆药代动力学特点表明：血浆半衰期约为3小时，目前给药方法无法达到稳态浓度；相同剂量给药个体间差异大，可能是影响疗效的原因之一，AUC 低于均值者应增加剂量。可采用有限采样法进行药物监测，调整用药剂量，指导个体化用药方法。
　　 3、人血红细胞内MTXPG 于服药后72小时已形成，每周1次服药可调整为每3天服药1次。服药8周患者血红细胞内MTXPG，检测量低者临床疗效欠佳。
　　 4、对小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎进行药物临测，依据AUC 调整用药剂量，同时监测人血红细胞内MTXPG，低于均值者继续增加剂量，或改用其他DMARD。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

前 言

第一部分 小剂量甲氨蝶呤血药浓度测定方法的建立

第二部分 单剂量甲氨蝶呤口服治疗药代动力学研究

第三部分 MTXPG 药物浓度测定方法的建立

第四部分 MTXPG 的药代动力学与临床疗效的相关性研究

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的研究进展

硕士学位研究生学习期间撰写论文