α-SYN和EN1在小鼠的发育学表达及其在PD模型中作用的实验研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见的与衰老有关的神经系统变性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病,临床上以静止性震颤、运动迟缓、僵直、姿势不稳定为主要症状,65岁以上人口中的患病率超过1％。Α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-SYN)是最初在1988年发现的一种突触末梢前蛋白,它是较早发现的与PD相关的基因,其编码的α-SYN蛋白是PD病人神经元内出现的一种蛋白包涵体结构-路易氏体(Lewybody)的主要组成成分。后来的研究发现,α-SYN的聚集是许多神经退行性疾病的病理学标志,包括PD、路易氏体痴呆(DLB)和多系统萎缩症(MSA)等,统称为突触核蛋白病(synucleinopathies)。
　　 关于α-SYN在发育过程中的表达,有研究者对α-SYN蛋白在小鼠大脑皮层发育过程中的表达进行了IHC检测,结果表明α-SYN首先在E12的边缘层表达,而后在皮质生长板的表达增强。另外,在成年人的嗅粘膜中检测到α-SYN的表达,并且在正常人与神经退行性疾病患者嗅粘膜的表达情况相同。因此,对于PD、阿尔茨海默病(AD)、MSA和其它神经退行性疾病的嗅觉功能障碍,α-SYN是否参与这个过程无从了解,而且目前尚无文献报道α-SYN是否参与了嗅粘膜的发育过程。虽然α-SYN在外周神经系统的表达目前尚未见到详细的报道,但是有研究者发现它在成年小鼠的背根神经节中表达。而α-SYN作为一个PD相关的蛋白,它在中脑发育过程中的表达情况如何呢?在胚胎发育过程中未见到详细的报道,而有文献报道在出生后的早期(P5-P7)的中脑黑质神经元胞体中有较强的表达,而成年后则在胞体以外的部分呈点状的表达。为了更好的了解α-SYN在发育过程中的作用,有必要阐明它详细的发育学表达情况。
　　 有研究表明,在α-SYN上游几千个bp以外的编码区存在两个与转录因子Engrailed(EN)高亲和力的结合位点,而EN作为一种转录因子能够根据其结合的不同位点起到转录激活或抑制的作用,这提示EN可能通过与α-SYN的上游启动子直接结合而调控它的表达。EN是一类同源结构域蛋白转录因子,它含有两种同系物,即EN1和EN2。EN在脊椎动物的胚胎发育过程中具有重要作用,它最初被认为只是果蝇的一个节段极性基因,后来被证实在胚胎发育过程中特别是神经系统发育过程中也发挥重要作用。近年的研究发现,EN控制着中脑多巴胺能神经元的发育和存活,在脊椎动物中对中后脑交界处结构的形成发挥关键作用,并且认为它可能与PD有关。关于EN在发育过程中的表达,以前的研究主要集中在发育早期阶段中枢神经系统(CNS)中的表达,而在发育晚期阶段和CNS以外的区域关注甚少。然而,EN1反义寡核苷酸靶向作用于发育早期体节阶段的小鼠胚胎后会导致脑、面部、心脏的缺陷,并且胚轴缩短。而EN1-/-敲基因小鼠胚胎出生即死,并造成中后脑的大部分缺失。基因打靶用EN2取代Enl的编码序列后,动物能够存活,并且不会有脑部的缺陷,但不能弥补EN1缺失导致的一些外周组织发育的异常。这些结果提示,与EN2相比,EN1在发育过程中起着更为重要的作用,并且在CNS以外的组织中起着EN2不能补偿的某些独立作用。为了更好的了解EN1蛋白在中脑多巴胺能神经元以及其它组织的发育过程中的作用,有必要详细的检测EN1在胚胎发育过程中的表达。
　　 根据文献报道,α-SYN和EN1都和中脑多巴胺能神经元有一定的关系,EN1被证实参与了多巴胺能神经元的发育和存活,而α-SYN的异常聚集可能是导致PD病人多巴胺能神经元死亡的原因。为了进一步研究α-SYN和EN1与多巴胺能神经元的关系,我们通过神经毒性药物6-羟基多巴胺(6-OHDA)单侧纹状体内注射,导致中脑多巴胺能神经元慢性退行性病变,从而模拟PD的慢性进展性疾病,通过检测α-SYN和EN1在多巴胺能神经元中的表达变化初步探讨它们与PD模型的关系。
　　 本文应用IHC、Western Blot等方法对α-SYN和EN1在小鼠的发育学表达及其与小鼠PD模型中多巴胺能神经元的关系进行了研究。主要结果如下:
　　 1.α-SYN在小鼠的发育学表达
　　 我们的研究表明,α-SYN最早在E9.5即开始在中枢神经系统(CNS)表达,刚开始局限在中后脑交界部位,后来在脑的许多区域都有表达,而在中脑的高表达持续到成年。在大脑皮层,α-SYN在发育早期的边缘层(MZ)表达,而后期在MZ和下板(SP)中表达,并且逐渐扩散到皮质板;在小脑,表达最早的部位为深部小脑核(DCN),随后表达扩散到皮质区并且DCN的表达减弱,最终α-SYN在浦肯野细胞层中表达最强。皮质板和DCN由发育过程中的神经元形成,而SP和MZ是发育中的神经元形成突触的部位,这提示α-SYN可能参与了神经元的发育和突触的形成;α-SYN在中脑的发育过程中呈持续的高表达提示它可能参与了中脑的发育。
　　 在CNS以外,α-SYN在感觉系统包括鼻粘膜、视网膜、一些感觉神经节以及它们支配的神经纤维等组织中都检测到表达。提示α-SYN可能参与了感觉系统的建立。
　　 在胚胎的早期发育过程中,α-SYN在神经元内具有明显的核内表达;在发育后期,α-SYN在细胞内主要定位于胞核以外的区域;而在成年小鼠,α-SYN主要在胞体以外的区域呈点状的突触样表达。这提示α-SYN可能在胚胎发育早期与神经元的发育相关,而在晚期可能与突触的形成和功能维持有关。
　　 2.EN1在小鼠的发育学表达
　　 IHC结果显示,EN1在E10.5小鼠CNS的表达局限在中后脑交界部位,在发育后期主要在中后脑交界部位来源的组织中表达,包括中脑、中脑导水管周围灰质、小脑、脑桥和上下丘等组织,值得注意的是在中脑多巴胺能神经元呈持续的强表达,这些结果提示EN1在CNS的发育过程尤其是中脑多巴胺能神经元的发育过程中可能起着重要的作用。
　　 在CNS以外,EN1在胚胎发育过程中的一些神经嵴来源的组织中呈一过性的动态表达,包括在颅面间充质下颌弓、迷走神经、背根神经节、交感神经节、体节、心脏和泄殖腔等,这提示EN1可能参与了神经嵴的发育。
　　 IHC和Western Blot结果表明,在CNS,EN1主要定位于胞核内,而在CNS以外,EN1主要表达于胞浆中。这种核浆定位的差异可能与它的功能相适应,在CNS,EN1可能主要作为转录因子参与神经系统的发育;在CNS以外,EN1可能作为一个分泌信号参与神经嵴的发育。
　　 3.α-SYN和EN1在PD模型中作用的实验研究
　　 通过6-OHDA单侧纹状体注射导致同侧中脑多巴胺能神经元的慢性进行性损伤,模拟PD的进展过程,观察在多巴胺能神经元损伤过程中α-SYN和EN1的变化情况。结果显示,6-OHDA单侧纹状体注射后,同侧黑质(SN)和腹侧被盖区(VTA)的TH阳性多巴胺能神经元和EN1阳性细胞都逐渐减少,快速死亡的时间主要发生在6-OHDA注射后的7天内,同时SN星形胶质细胞大量增生。在6-OHDA注射后1天和3天,α-SYN在多巴胺能神经元内出现明显的聚集,7天后恢复正常水平。
　　 在6-OHDA注射后1天,TH阳性的多巴胺能神经元还未出现显著的减少,而此时EN1阳性细胞已经出现显著的减少,并且α-SYN开始在多巴胺能神经元内聚集。注射后7天,当细胞死亡的数量逐渐减少时,高表达α-SYN的细胞也逐渐减少。WesternBlot结果也显示,注射后1天和3天α-SYN的表达升高,而7天后恢复正常水平。因此,α-SYN的聚集可能是导致多巴胺能神经元死亡的原因,而EN1可能在这个过程中对α-SYN的表达主要起着转录抑制的作用。
　　 综上所述,本文详细的阐明了α-SYN和EN1在小鼠的发育学表达模式。Α-SYN在发育中的神经元、突触形成部位以及感觉系统呈高表达,提示它可能参与了神经元的发育和迁移、突触的形成以及感觉系统的建立。EN1在中脑多巴胺能神经元和神经嵴来源的组织中呈高表达,提示它在中脑多巴胺能神经元的发育和存活过程中可能起着重要的作用,并且可能参与了神经嵴的发育。另外,通过建立6-OHDA纹状体注射的PD模型,探讨α-SYN和EN1在多巴胺能神经元损伤过程中的作用,结果提示α-SYN在细胞内的聚集可能是6-OHDA注射后导致多巴胺能神经元死亡的原因,而EN1在这个过程中可能对α-SYN起着转录抑制的作用。本研究希望通过揭示多巴胺能神经元损伤的参与因素,为寻找PD的预防和治疗靶点提供一定的基础实验资料。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:常用英文缩写一览表

前言

总材料与方法

第一部分 α-SYN在小鼠的发育学表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 EN1在小鼠的发育学表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 α-SYN和EN1在PD模型中作用的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

致谢

照片

附表

文献综述 Engrailed:脊椎动物中一种多功能转录因子

攻读博士期间发表主要论文