软骨内PTEN基因特异性敲除对FGFR3功能增强型点突变所致软骨发育不全的影响及机制的初步研究

摘要

软骨发育不全是一种常染色体遗传病，是人类侏儒最常见的类型，其发生主要是De novo基因突变的结果，目前尚无有效的治疗方法。软骨发育不全主要影响四肢骨、椎骨等长骨(Long Bone)的软骨内成骨(Endochondral Ossification)过程，尤其是软骨生成(Chondrogenesis)过程，包括间充质细胞集聚并分化为软骨细胞，以及随后软骨细胞的增生、肥大和凋亡，但其机制目前并不完全清楚。 骺生长板软骨细胞增生与分化的调控，对长骨的纵向生长和骨骼的发育至关重要。长骨生长板受多种信号分子的调控，其中成纤维细胞生长因子及其受体(FibroblastGrowth Factors/Fibroblast Growth Factor Receptors，FGFs/FGFRs)在其中起重要作用。目前认为，通过非配体依赖的自主激活，FGFR3的十多种功能增强型(Gain-of-function)点突变可引起多种人类软骨发育障碍性侏儒，包括软骨发育不全(Achondroplasia，ACH)、季肋发育不全(Hypochondroplasia， HCH)、致死性骨发育不全(ThanatophoricDysplasia， TD)和严重软骨发育不良伴发育迟缓和黑棘皮症(Severe Achondroplasia with.Developmental Delay and Acanthosis Nigricans，SADDAN)等，其中95％以上的软骨发育不全患者由FGFR3的功能增强型突变引起。 Deng等发现，FGFR3基因敲除小鼠(FGFR3-/-)有长骨过度生长、生长板增生软骨细胞带和肥大软骨细胞带变宽、软骨细胞增殖活性增加；相反，Chen等人利用基因敲入技术建立了模拟人ACH的FGFR3G369C点突变小鼠模型(相当于人源FGFR3G375C)，这种小鼠FGFR3功能增强，个体明显短小，头颅短圆，长骨生长板组织形态结构异常，软骨细胞增生带短稀，增生能力减弱、肥大软骨细胞明显减少伴CollagenX表达减低(即软骨细胞分化能力降低)，表明FGFR3是长骨软骨生成的负性调节分子，影响软骨细胞的增殖活性和分化。目前研究FGFR3突变引起的软骨发育异常主要集中于STAT1/p21和ERK-MAPK信号通路上，但抑制此两条信号通路，并不能完全缓解FGFR3突变所致的侏儒表型，提示可能存在其他信号通路参与了对软骨发育异常的调控。 越来越多的研究表明PI3K/AKT信号通路在哺乳动物骨骼发育和细胞增殖分化中起重要作用，成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子(Insulin-like GrowthFactors，IGFs)、胰岛素等对软骨发育和功能重要的生长因子均能激活该通路。PTEN，即第10号染色体同源缺失性磷酸酶.张力蛋白基因(phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten， PTEN)，是PBK/AKT通路中一个重要的负性调控分子。研究发现在小鼠成-软骨前体细胞中敲除PTEN后影响生长板软骨细胞的增殖与分化。但是，该通路在FGFR3介导的软骨发育不全中的作用目前尚不清楚，需要进一步研究。 鉴于FGFR3在软骨发育不全致病机理中的地位以及PBK/AKT活性在软骨细胞增生抑制和分化延迟中的重要作用，本研究采用条件性基因敲除技术建立了软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠模型，通过分析相关小鼠的表型，观察在FGFR3功能增强型小鼠软骨细胞特异性敲除PTEN基因后对软骨发育的影响，并初步探讨PTEN基因敲除影响软骨发育的可能的分子机制。 主要实验方法： 1.利用基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，建立了软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠模型，PCR鉴定小鼠基因型及免疫荧光鉴定敲除效率； 2.采用X线摄影、全骨架染色和头颅局部摄影，观察小鼠大体形态及颅底软骨联结的变化情况，测定小鼠生长过程中体重、体长、躯干长、尾长和尾椎椎体长度的变化； 3.制备了不同年龄不同基因型小鼠的组织切片，通过HE染色，观察生长板形态和第二骨化中心的发育情况；通过BrdU掺入后免疫组化检测，观察生长板软骨细胞增殖情况； 4.采用定量PCR检测软骨分化相关基因COL2A1、COL10A1和IHH的表达情况；Westem Blot检测p-AKT水平，激光共聚焦显微术检测了软骨组织中p-AKT的水平并进行了定位观察； 5.建立胎鼠胫骨及跖骨体外培养模型：采用bpV处理阻断PTEN，观测对跖骨生长率的影响。 主要实验结果： 一、软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠的获得 利用FGFR3功能增强点突变小鼠(Fgfr3G369C/+小鼠，即ACH小鼠)，Ptenftox/flox小鼠以及软骨细胞中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠(Col2αCre小鼠)设计交配策略，获得了基因型为Col2αCre:Ptenfiox/flox；ACH的小鼠。该小鼠为软骨细胞特异性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型小鼠。采用免疫荧光化学对该小鼠软骨细胞中PTEN的表达情况进行了鉴定，证实PTEN在软骨细胞中因为基因敲除而表达显著降低。 二、PTEN基因敲除对ACH小鼠一般生长情况的影响 1.PTEN基因敲除对ACH小鼠体重、体长、尾长、椎体长度的影响：①在观测期3-10w内，CAP小鼠体重增长较AP小鼠明显；②4w的CAP小鼠体长、尾长明显长于AP小鼠，但是两者椎体长度差异不显著。 2.PTEN基因敲除对ACH小鼠头颅及颅底软骨联结的影响：①CAP小鼠头颅圆钝的状况较AP小鼠有所改善；②CAP小鼠的颅底软骨联结闭合时间较AP小鼠延迟。 三、PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨内成骨的影响 1.PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨细胞增殖的影响：出生5d和14d小鼠BrdU掺入检测后发现，CAP小鼠软骨细胞增殖指数较AP小鼠高，提示：CAP小鼠软骨细胞增殖活性较AP小鼠高； 2.PTEN基因敲除对ACH小鼠软骨细胞分化的影响：观察出生7d、12d小鼠的生长板，发现CAP小鼠的第二骨化中心较AP小鼠的提前出现，16d时CAP小鼠生长板软骨细胞未增殖带明显较AP小鼠窄，提示：CAP小鼠软骨细胞分化较AP小鼠快； 3.荧光定量PCR结果显示：7d时，AP小鼠关节软骨中COL2A1 mRNA比CAP小鼠高，CAP小鼠COL10A1 mRNA表达较AP小鼠高，提示CAP小鼠软骨细胞分化较AP小鼠加快。 4.PTEN基因敲除对ACH小鼠产生影响的可能机制：AP小鼠软骨组织未检测到p-AKT，而CAP小鼠p-AKT水平显著高于AP小鼠，提示：敲除PTEN后对ACH小鼠增殖与分化产生的影响可能是由于AKT磷酸化水平改变引起。 四、胎鼠胫骨体外培养模型的建立及阻断PTEN后对胎鼠跖骨生长的影响 建立了ACH胎鼠(E16.5)胫骨体外培养7d，14d的模型，显示ACH胎鼠胫骨生长率较野生慢。ACH胎鼠(E16.5)跖骨在给予不同浓度bpV后结果显示：处理组跖骨生长率明显较未处理组高，提示：给予bpV处理阻断PTEN后，PI3K/AKT通路活化，促进了软骨的生长。 主要结论： 通过上述实验结果分析，我们发现小鼠软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3功能增强型点突变所引起的侏儒表型。主要表现为： 1.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠大体表型较FGFR3功能增强型小鼠有所缓解； 2.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠生长板软骨细胞增殖活性较FGFR3功能增强型小鼠增高，提示PTEN基因的条件性敲除，可以缓解FGFR3功能增强所致的软骨细胞增殖抑制； 3.软骨细胞特异性敲除PTEN的FGFR3功能增强型小鼠生长板软骨细胞较AP小鼠软骨细胞分化加快，提示PTEN基因敲除可缓解FGFR3功能增强所致的分化抑制； 4.PBK/AKT信号通路在软骨发育中发挥重要作用，AKT活性降低是FGFR3功能增强所致软骨细胞增殖抑制和分化延迟的重要机制之一。进一步地采用bpV处理ACH胎鼠跖骨也发现阻断PTEN使PBK/AKT通路活化，促进了软骨的生长。但是，FGFR3功能增强所致软骨细胞中AKT活性降低的机制尚需进一步研究。

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文献综述　PTEN在骨骼发育及相关疾病中的作用

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