邻苯二甲酸二丁酯宫内暴露下的多代雄性生殖毒性及睾丸DNA甲基转移酶的改变

摘要

环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)是一类能干扰机体天然激素合成、分泌、转运、结合或清除的各种外源性物质。这类物质可导致动物和人类生殖功能障碍、生殖能力下降、幼体灭亡甚至灭绝等，其对人群健康的危害受到国内外专家广泛关注。众多环境内分泌干扰物中以邻苯二甲酸酯类(phthalic acidesters，PAEs)污染最为严重，邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate，DBP)是其代表物之一。本室前期研究发现流经重庆主城区的嘉陵江及长江水中，DBP检出量最高可达9．48μg/L。而化学安全国际计划(the International Program on Chemical Safety，IPCS)所估计的饮用水中。DBP暴露量小于1．0μg/L。 美国国家毒理学计划(National Toxicology Program，NTP)的研究确认DBP具有显著的雄性生殖毒性及发育毒性。大量动物资料显示，大鼠宫内DBP暴露可致雄性子代睾丸萎缩、附睾畸形、隐睾症和尿道下裂等病变。有研究发现，DBP暴露不仅影响F0代大鼠，还可影响F1代乃至F2代的生殖和发育。IPCS综述了关于DBP致突变性的文献后认为DBP不具有遗传毒性，因此损伤机制有可能来自于遗传外机制。近年来，表观遗传学(epigenetics)已成为基因表达调控的研究热点，它是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因的功能发生了可遗传的改变，并最终导致表型的变化。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一，在胚胎早期发育、组织特异性的基因表达和大部分基因沉默中起关键作用。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶介导的，目前发现哺乳动物体内具有转甲基活性的酶有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。DNA甲基转移酶的改变可导致基因组DNA甲基化的异常和表遗传调节的紊乱。因此，我们推测DBP的雄性生殖毒性可能是通过影响DNA甲基转移酶表达实现的。 目前关于DBP宫内暴露对雄性仔鼠生殖系统影响的研究使用的剂量都比较高，大多数都在500mg/kg以上，远远超过了人类可能的最大摄入量(1131μg/kg)。而实际上环境和生物体内所含的DBP浓度经常是非常低的，所以研究低剂量下DBP的生物学效应更有意义。本研究以未观察有害效应水平(NOAEL)50mg/kg为最低剂量对亲代孕鼠进行宫内暴露，验证DBP对F1代雄性大鼠的生殖影响，观察DBP对雄性的生殖损伤能否持续至F2代，并通过分析F1代和F2代睾丸DNA甲基转移酶的基因表达改变，探索DBP对雄性生殖损伤是否通过表遗传学机制起作用。 方法： 1．多代繁殖动物模型： SPF级SD孕鼠72只，随机分为五组，分别为玉米油(Corn oil)对照组(相对于DBP的溶剂对照)、DBP50mg/(kg·d)组(简称DBP50)、DBP250mg/(kg·d)组(简称DBP250)，每组各20只孕鼠，DMSO对照组(相对于Vinclozolin的溶剂对照)、Vinclozolin100mg/(kg·d)组(简称Vin100)每组各6只孕鼠。自妊娠第8天(GD8)至妊娠第21天(GD21)，按2ml/kg灌胃量每日对亲代孕鼠经口灌胃染毒。同剂量组不同窝别的F1代仔鼠于出生后第90天按雌雄比1:1交配产生F2代仔鼠。 2．观察指标： 1)F0代及F1代孕鼠：大鼠一般生长情况、体重增长情况、繁殖功能(雌鼠妊娠时间、产仔数、活仔数、仔鼠出生窝重、仔鼠出生平均体重、性别比率、哺育4天存活率)和脏器重量等。 2)F1代及F2代雄性仔鼠：仔鼠一般生长情况、出生后4天肛殖距、脏器重量、睾丸及附睾病理组织学观察、精子评价。 3)采用逆转录聚合酶链扩增(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法检测F1代及F2代雄性仔鼠睾丸组织中DNA甲基转移酶mRNA的表达。 3．统计分析 用SPSS11．5统计软件对数据进行统计分析，计数资料用卡方检验，计量资料用方差分析，数据用x±s的形式表示。P<0．05表示差异有统计学意义。 结果与讨论： 1．DBP宫内暴露多代繁殖动物模型的建立 整个实验期间，大鼠饮食饮水状况正常，生长情况良好，根据OECD实验指南和Skinner等的四代动物模型建立DBP宫内暴露多代繁殖动物模型，所得结果与相关多代繁殖实验大体一致，说明成功建立了多代繁殖动物模型。 与玉米油对照组相比，DBP50组F1代仔鼠的出生体重以及肝脏系数降低(P<0．05)，刺激F1代孕鼠哺乳期体重增长(P<0．05)，这有可能是DBP低剂量的hormesis效应；F2代肾脏系数增加(P<0．05)。 DBP250组，F0代孕鼠哺乳期体重降低，F1代仔鼠出生窝重以及PND21和PND28的体重降低(P<0．05)，说明DBP可影响F0代孕鼠的繁殖以及F1代仔鼠的生长。F1代雄性仔鼠心脏系数增加，F2代雄性仔鼠肝脏系数降低，睾丸脏器系数增加(P<0．05)。其余指标各组间差异无统计学意义(P>0．05)。 2．DBP宫内暴露对F1及F2代雄性仔鼠生殖系统的影响 与玉米油对照相比，DBP50组F2代精子体、尾部畸形率增加(P<0．05)，但总畸形率差异无统计学意义(P>0．05)。DBP250组F1代雄性仔鼠肛殖距缩短(P<0．05)，精子数目明显减少(P<0．01)，精子头部、体部及总畸形率增加(P<0．05)以及睾丸曲细精管变性率增加；F2代雄性仔鼠精子头部及总畸形率增加(P<0．05)。这说明DBP对F1及F2代雄性仔鼠生殖均有损伤作用，对F2代的损伤仅观察到精子畸形率的增加。 3．DBP宫内暴露对F1及F2代雄性仔鼠睾丸DNA甲基转移酶mRNA表达的影响 F1代雄性仔鼠：与玉米油对照组相比，DBP各剂量组Dnmtl基因表达差异无统计学意义；与DBP50组相比，DBP250组Dnmtl基因表达显著升高(P<0．05)。与玉米油对照组相比，DBP50组和DBP250组Dnmt3b基因表达均降低(P<0．05)。与DMSO溶剂对照组相比，阳性对照组Vin100的Dnmt1和Dnmt3b基因表达显著降低(P<0．05)。 F2代雄性仔鼠：与玉米油对照组相比，DBP50组Dnmt3b基因表达降低(P<0．05)DBP250组Dnmt1基因表达升高，Dnmt3b基因表达降低(P<0．05)。与DMSO溶剂对照组相比，阳性对照组Vin100的Dnmt1基因表达显著增加(P<0．05)。 以上结果表明，DBP宫内暴露对F1代及F2代大鼠睾丸Dnmt1和Dnmt3b基因表达均有影响。 结论： 综上所述，我们发现宫内暴露DBP能干扰F0代孕鼠的生长与繁殖，引起F1代与F2代雄性仔鼠心、肝、肾、睾丸脏器系数的改变，是否毒性所致还需进一步观察。DBP对F1代雄性生殖系统损伤明显，表现在肛殖距缩短、精子数目减少、精子畸形率增加以及睾丸曲细精管变性率增加，但F2代仅观察到精子畸形率增加。DBP增加F1代与F2代雄性仔鼠睾丸组织Dnmt1的mRNA表达，降低Dnmt3b的mRNA表达。结合Dnmts的mRNA表达情况和生殖系统出现的损伤结果，我们推测DBP有可能通过改变Dnmts的表达，导致某些基因的过表达或抑制，从而使雄性子代生殖系统受损。 创新性 1．本研究观察了DBP亲代宫内暴露对SD大鼠三代生殖及发育的影响，发现DBP对F1代雄性仔鼠生殖系统有明显损伤，对F2代雄性仔鼠仅观察到精子畸形率的改变。我们还发现DBP不仅损害雄性子代的生殖系统，还引起其他实质性器官的发育异常。 2．本研究在体内动物实验中观察到宫内暴露于DBP可导致能延续至子二代的DNA甲基转移酶的异常改变。 研究不足之处 由于时间的限制，我们的研究还有不完善的地方，比如Dnmts在蛋白质水平上的验证工作，以及睾丸发育相关基因启动子序列的DNA甲基化改变等。 下一步计划 下一步我们打算利用甲基敏感任意引物聚合酶链法对基因组DNA差异甲基化片段进行筛选，旨在能筛选到高甲基化或低甲基化片段，再进行Blast序列比对分析，确认具体是哪些基因或基因的调控区发生了改变。另外选取与睾丸发育的相关基因，分析其启动子序列DNA甲基化的改变，以更深入地了解DBP引起雄性生殖损伤的表遗传效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

技术路线图

前 言

第一部分DBP宫内暴露的多代繁殖模型的建立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分DBP对F1及F2代雄性仔鼠生殖毒性的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分DBP对F1及F2代雄性仔鼠DNA甲基转移酶的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 环境内分泌干扰物与DNA甲基化的研究进展

硕士在读期间发表的论文情况