SIGIRR对气道上皮TOLL样受体致炎信号通路的作用及机制研究

摘要

背景与目的：
　　 TOLL样受体(TLRs)广泛分布于人的气道上皮细胞中,它们介导了病原微生物所致呼吸道感染时的气道炎症反应。单免疫球蛋白样白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)是TIRs超家族成员,它可以负性调节TLR/IL-1受体介导的固有免疫应答。本实验是以人气道上皮细胞株H292作为研究对象,明确SIGIRR在人气道上皮细胞中发挥的作用及可能的细胞内机制。
　　 方法:
　　 1.SIGIRR的亚细胞定位研究
　　 (1)构建一个增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的重组真核细胞表达质粒载体(SIGIRR-EGFP),并经测序证实。
　　 (2)运用脂质体转染的方法,将重组质粒(SIGIRR-EGFP)瞬时转染H292细胞,在激光共聚焦显微镜下,进行亚细胞定位研究,并以空质粒pEGFP-N1转染的H292细胞(EH292)、未转染的H292细胞(H292)对照。
　　 (3)采用免疫细胞化学的方法进行亚细胞定位对照,进一步证明SIGIRR在H292细胞中的亚细胞定位情况。
　　 2.致炎因子的ELISA检测
　　 (1)通过800gg/ml的G418筛选稳定转染细胞,单克隆化操作后,利用荧光定量RT-PCR挑选出SIGIRR表达相对较强的细胞株(RH292-2),作为进一步实验的对象(RH292)。
　　 (2)对获得的RH292、EH292、H292细胞计数后,以1×106接种于12孔板的每个孔中,当生长到70～80％的时候,进行减血清培养24hrs,再分别用Flagellin(1,0.2,和0.05μg/ml),LPS(1,0.2,和0.05μg/ml)and CpG DNA2006(1,0.2,和0.05μM)处理细胞6hrs后,ELISA检测各孔细胞培养上清中IL-6及TNF-α的浓度。
　　 3.Western blot检测SIGIRR和TLR4、5、9表达
　　 (1)对RH292、EH292、H292细胞计数后,以1x106接种于6孔板中,待生长至90％左右时,分别收集细胞,并检测各组细胞中TLR4、5、9表达情况;
　　 (2)用LPS(1μg/m1),Flagellin(0.1μg/m1)and CpG DNA2006(0.5μM)分别处理上述三组细胞24hrs,在刺激的1、6、24 hrs时,分别收集并检测三组细胞中SIGIRR和TLR4、5、9的表达情况。
　　 4.免疫共沉淀检测SIGIRR与MyD88的相互作用。
　　 (1)用LPS(1μg/m1)、Flagellin(0.1μg/m1)、CpG DNA2006(0.5μM)处理6孔板中生长至90％左右的RH292、EH292、H292细胞6hrs后,分别收集细胞裂解液。
　　 (2)用1μg SIGIRR多抗和20μ1蛋白A-琼脂糖珠,4℃共孵育过夜,再用裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠4次后,行SDS-PAGE分离。
　　 (3)Western blotting分析SIGIRR和MyD88蛋白表达情况,并以β-actin的表达代表每个样品种细胞裂解液上样量。
　　 结果:
　　 1.激光共聚焦观察显示融合蛋白SIGIRR-EGFP主要表达在H292细胞的细胞膜上,在细胞核周有少量表达,但不进入细胞核,而空质粒pEGFP-N1转染的EGFP则在整个细胞中弥散分布;免疫细胞化学染色显示重组融合蛋白SIGIRR-EGFP与H292细胞中内源SIGIRR共定位于细胞膜上,说明SIGIRR在H292细胞中定位于细胞膜上。
　　 2.成功筛选出了两个SIGIRR过表达的细胞株RH292-1和RH292-2,实时荧光定量RT-PCR显示这两个细胞株中SIGIRRmRNA是未转染H292细胞的14和44倍。故选择RH292-2作为进一步实验对象(RH292);在三种不同浓度的特异性配体LPS、Flagellin、CpG DNA2006处理之后,SIGULR过表达的H292细胞(RH292)产生的致炎因子IL-6浓度分别为39.52±0.62、39.12±0.51、33.32±2.38pg/ml,58.61±1.13、28.354±1.05、14.24±0.93 pg/ml,5.12±0.22、3.27±0.13、2.37±0.46 pg/ml,TNF-α浓度分别为78.45±2.11、69.56±2.47、64.32±1.72 pg/ml,58.29±1.91、48.53±0.78、24.49±0.66 pg/ml,10.25±0.67、8.29±0.35、4.54±0.60 pg/ml,均显著低于空质粒转染(EH292)组或未转染细胞(H292)组(P＜0.01),而后两者IL-6和TNF-α的表达水平则没有统计学差异(P＞0.05),说明SIGIRR降低了H292细胞TLR4、5、9介导的致炎因子表达。
　　 3.实时荧光定量RT-PCR和Western blotting显示H292细胞转染前后,即RH292细胞、EH292、H292中TLR4、5、9的mRNA和蛋白表达水平无显著差异(P＞0.05);进一步在一定浓度的LPS、Flagellin、CpG DNA2006处理1、6、24hrs后,各组细胞中TLR4、5、9的蛋白表达也没有显著性差异(P＞0.05),说明过表达SIGIRR不能调节H292细胞中FLR4、5、9的表达;此外,在受到外界病原分子刺激时,SIGIRR和TLR4、5、9表达早期迅速减少,然后逐渐增加至24时,呈时间依赖性模式,这种相似的表达模式也反应了炎症应答时的免疫平衡;
　　 4.通过SIGIRR与MyD88免疫共沉淀实验,可见H292细胞经过LPS,Flagellin和CpG DNA2006处理1 h后,SIGIRR与MyD88分子发生明显的相互作用。在同一浓度配体刺激下,RH292细胞中与SIGIRR结合的MyD88分子显著(P＜0.05)多于EH292和H292,而与SIGIRR结合的MyD88分子在EH292和H292中则没有统计学差异(P＞0.05)。提示人气道上皮细胞受到TLRs的配体刺激后,SIGIRR与MyD88有较强相互作用,即SIGIRR可能与TLR4、5、9竞争结合MyD88接头分子。
　　 结论:
　　 1.成功构建了真核细胞表达载体SIGIRR-EGFP,证实了SIGIRR在人气道上皮细胞中亚定位于细胞膜上,是一个膜受体蛋白。
　　 2.SIGIRR可以显著降低人气道上皮细胞TLR4、5、9介导的炎症介质产生。
　　 3.SIGIRR抑制人气道上皮细胞,致炎因子产生的作用不是降低了TLR4、5、9的表达所致,而是通过与Toll样受体竞争结合MyD88接头分子,从而减少了炎症信号细胞内转导的结果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一章 SIGIRR对气道上皮TOLL样受体致炎信号通路的作用

第一节 真核表达载体SIGIRR-EGFP的构建与鉴定

材料与方法

结果

第二节 气道上皮细胞中SIGIRR亚细胞定位研究

材料与方法

结果

第三节 SIGIRR过表达对气道上皮细胞致炎因子产生的影响

材料与方法

结果

讨论

第二章 SIGIRR对气道上皮TOLL样受体致炎信号通路调控机制研究

第一节 SIGIRR过表达对气道上皮细胞TLR4、5、9表达的影响

材料与方法

结果

第二节 SIGIRR与Toll样受体接头分子MyD88的相互作用

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 TOLL样受体介导免疫应答的负性调节

攻读博士学位期间发表的论文

英文论著