EGCG拮抗微囊藻毒素LR诱导小鼠肝细胞氧化损伤以及Ⅰ相酶、Ⅱ相酶、Nrf2参与作用研究

摘要

自然水体频繁受蓝藻水华污染已成为世界环境问题。大部分蓝藻会产生危害严重的微囊藻毒素(Microcystin,MC),威胁到人类的生命安全。国内外对MC毒性机制方面研究较多,而对其造成机体损伤的防护措施研究较少。目前国内外尚无有效控制微囊藻水华的手段和措施,故寻找能够有效预防、减轻MC健康危害的天然解毒剂具有重要的现实意义。
　　 MC的代表亚型微囊藻毒素LR(MC-LR)是一种具有强烈的肝毒性、促癌活性和肾毒性的环状七肽,能破坏机体的抗氧化防御系统,引起组织器官的氧化损伤。肝脏是MC-LR作用的靶器官,其中含有丰富的Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶类。Ⅰ相酶主要负责外来物质的生物转化,最主要的是细胞色素P450酶家族。CYP2E1是P450家族中比较重要的亚型之一。Ⅱ相酶主要负责对外来物质进行失活、解毒。(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶多酚(GTP)有效成分儿茶素中最有效、生物活性最强的成分,具有很强的抗氧化作用、抗肿瘤作用和化学保护作用。我们前期研究已经发现GTP能够减轻MC-LR所致小鼠肝脏氧化损伤,但其具体的机制仍不明确。由于有研究表明一些抗氧化剂包括EGCG可以通过Nrf2/ARE通路诱导Ⅱ相酶和抗氧化物酶来清除体内的毒物,也有报道称儿茶素特别是EGCG可以通过细胞色素P450酶抑制外源性化学物的代谢活化,从而发挥它的抗氧化、抗肿瘤作用。因此,本研究建立了EGCG拮抗MC-LR毒性亚急性染毒模型,在给予小鼠MC-LR染毒的情况下同时给予不同浓度的EGCG干预,第一部分观察MC-LR对于肝脏抗氧化物酶的影响以及EGCG对MC-LR诱导氧化损伤的拮抗效应。第二部分研究了EGCG干预下,Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和Nrf2在肝细胞内的表达差异以及它们在拮抗MC-LR毒性中具体作用,进一步探讨EGCG拮抗微囊藻毒素LR诱导氧化损伤的分子机制。
　　 研究内容:
　　 1.建立EGCG拮抗MC-LR毒性亚急性染毒模型
　　 SPF级健康Balb/c小鼠84只,雄性,5周龄,体重18 g～22 g,室温22℃±2℃、湿度75％±5％条件下适应性饲喂1周后按随机数字表法分组,分别进行了15天和30天实验。
　　 15天实验:小鼠24只,分为4组,每组6只。具体如下:对照组(生理盐水0.01ml/g灌胃+生理盐水0.01ml/g腹腔注射)、MC-LR染毒组(生理盐水0.01ml/g灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射)、EGCG低剂量拮抗组(EGCG10mg/kg灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射)、EGCG高剂量拮抗组(EGCG50mg/kg灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射),每日一次,持续15 d。
　　 30天实验:小鼠60只,分为6组,每组10只。具体如下:对照组(生理盐水0.2ml灌胃+生理盐水0.2ml腹腔注射)、MC-LR染毒组(生理盐水0.2ml灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射)、EGCG组(EGCG10mg/kg灌胃+EGCG10mg/kg腹腔注射)、EGCG低剂量拮抗组(EGCG10mg/kg灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射)、EGCG中剂量拮抗组(EGCG25mg/kg灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射)、EGCG高剂量拮抗组(EGCG50mg/kg灌胃+MC-LR10μg/kg腹腔注射),隔天一次,连续30 d。
　　 实验过程中每个实验日记录小鼠体重和变化。末次染毒24h后,颈椎脱臼处死全部动物,收集肝脏,低温冻存。
　　 2.EGCG对MC-LR诱导氧化损伤的拮抗效应研究
　　 对小鼠肝脏进行相应处理后,检测肝体比重、肝脏组织病理变化、脂质过氧化水平、抗氧化物酶(SOD、GSH、GPx)的活力以及基因、蛋白表达情况。
　　 3.Ⅰ、Ⅱ相酶和Nrf2参与EGCG拮抗微囊藻毒素LR诱导氧化损伤的作用研究
　　 检测肝细胞内Ⅰ相酶(CYP2E1)、Ⅱ相酶(GST)的活力;运用RT-PCR、免疫组化方法检测各实验组小鼠CYP2E1、GST、Nrf2基因和蛋白的表达改变。
　　 研究结果:
　　 1.动物生长发育:MC-LR染毒后小鼠生长、发育显著受到抑制,体重明显下降(P＜0.05);EGCG中、高剂量组小鼠体重明显高于MC-LR染毒组(P＜0.05)。这提示EGCG可以一定程度拮抗MC-LR对小鼠生长、发育的抑制。
　　 2.肝体比重:MC-LR染毒组小鼠肝体比重最高,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。EGCG拮抗组肝体比重与MC-LR染毒组相比显著降低(P＜0.05)。结果提示EGCG可以抑制MC-LR中毒造成的肝体比重升高。
　　 3.肝脏病理学改变:光镜下MC-LR染毒组小鼠肝细胞排列紊乱,结构不清,细胞融合,小叶中央静脉周围细胞坏死、浸润,Kupffer细胞局部增生肥大。电镜下线粒体明显肿胀,嵴数量减少,粗面内质网扩张,大量溶酶体和脂滴出现;细胞核形态异常。EGCG中、高剂量拮抗组小鼠肝细胞结构相对清晰,细胞融合减少,Kupffer细胞减少,线粒体肿胀减轻,内质网扩张减轻,细胞核较正常。表明EGCG可以减轻MC-LR中毒造成的肝脏病理损伤。
　　 4.脂质过氧化水平:MC-LR染毒组小鼠肝脏MDA含量显著升高(P＜0.05);EGCG三个剂量拮抗组MDA含量较单纯MC-LR染毒组均显著降低(P＜0.05)。这提示EGCG可显著抑制MC-LR所致小鼠脂质过氧化水平的升高。
　　 5.抗氧化酶水平:EGCG中、高剂量拮抗组SOD、GPx、GSH在肝细胞的活力及表达水平明显高于MC-LR染毒组,呈现良好的剂量-反应关系。结果表明EGCG提高了抗氧化酶活力从而减轻MC-LR染毒所致小鼠肝脏明显的氧化损伤。
　　 6.Ⅰ相酶、Ⅱ相酶水平:MC-LR染毒组较对照组明显升高肝细胞CYP2E1的活力和基因、蛋白表达(P＜0.05),EGCG三个剂量拮抗组CYP2E1活力、基因和蛋白表达明显低于MC-LR染毒组(P＜0.05);EGCG中、高剂量拮抗组GST活力及表达水平明显高于MC-LR染毒组,呈现良好的剂量-反应关系。EGCG可抑制Ⅰ相酶CYP2E1活力和表达,提高Ⅱ相酶GST活力和表达。
　　 7.Nrf2基因、蛋白表达:MC-LR染毒组和全部EGCG拮抗组Nrf2基因、蛋白表达明显高于对照组(P＜0.05);EGCG中、高剂量拮抗组Nrf2基因、蛋白表达较单纯MC-LR染毒组上调(P＜0.05)。给予EGCG、MC-LR均可以上调Nrf2表达。
　　 结论
　　 1.EGCG通过减轻肝脏病理损伤、降低脂质过氧化水平、提高抗氧化酶活力从而拮抗MC-LR亚急性染毒所致肝脏的氧化损伤。
　　 2.CYP2E1可能是MC-LR诱导活性氧产生的一个潜在根源。EGCG可以抑制CYP2E1活力与表达,减少体内ROS生成,参与对MC-LR毒性的拮抗效应。
　　 3.EGCG可通过激活Nrf2,增加Nrf2表达来诱导Ⅱ相酶和抗氧化酶产生,从而提高这些酶活力和表达,清除过多的ROS和自由基,拮抗MC-LR导致的氧化损伤。
　　 我们的研究建立了同时给予MC-LR和EGCG的亚急性动物染毒模型,证实MC-LR诱导了氧化应激,发现EGCG具有拮抗MC-LR所致氧化损伤的效应,此效应可通过抑制Ⅰ相酶CYP2E1,激活Nrf2/ARE通路诱导Ⅱ相酶和抗氧化酶产生而实现。我们研究涉及的内容国内外尚未见报道。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

前言

第一部分 EGCG对微囊藻毒素LR诱导氧化损伤的拮抗效应研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分 Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和Nrf2参与EGCG拮抗微囊藻毒素LR诱导氧化损伤的作用研究

材料和方法

结果

讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 对抗微囊藻毒素毒性的化学保护剂研究进展

在读期间发表及完成的论文