一氧化氮对HaCat细胞迁移功能的影响及机制研究

摘要

烧伤是以皮肤损伤为始发因素的特殊类型创伤,其主要问题是创面问题,如何尽早封闭、修复创面是烧伤治疗的根本任务。创面愈合一直是医学研究的重要领域,但讫今包括浅度烧伤创面在内的创面愈合机理并不完全清楚。
　　 研究表明,创面的封闭主要依赖于残存、健在的皮肤表皮干细胞(epidermal stemcell,ESC)增殖、分化,并最终修复创面,尤其是来自于毛囊外鞘隆突部(bulge)的表皮干细胞在其中起着十分重要的作用。仅当表皮干细胞离开其固有巢穴,才具有迁移、分化、增殖,并最终封闭修复创面的能力。故表皮干细胞离巢是启动包括烧伤在内的创面自行愈合的关键步骤。
　　 我们前期实验发现,烧伤后创面即有大量内源性NO产生,刚开始主要产自角朊细胞,随后主要由活化巨噬细胞产生。与其它类型创面相似,烧伤创面局部的NO很快于伤后第三天达到高峰,并几乎存在于创面愈合的全过程。研究发现,NO不光可促进烧伤创面上皮化、肉芽组织形成等,还能明显促进糖尿病创面的愈合,但NO在烧伤后表皮干细胞离巢、迁移等生物学行为变化中的作用并未见文献报道。烧伤后早期即有NO的大量产生,其产生时间上与烧伤后表皮离巢迁移相重叠,NO又能促进烧伤创面的愈合,而表皮干细胞是启动创面愈合的关键步骤之一,故有理由推测,NO很可能在表皮干细胞离巢过程中起着重要作用。
　　 为了验证这一假说及其具体作用机制,我们选取HaCat细胞作为模型,硝普钠(SNP)作为NO供体,从RhoGTP酶、细胞骨架、整合素等方面探讨了NO对细胞迁移影响的机制。
　　 研究内容和方法:
　　 1、以细胞密度为105个/ml接种1ml细胞至12孔板,细胞达到85％左右的融合度时进行划痕操作,换液后加入含有终浓度分别为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L硝普钠及10μmol/L丝裂霉素的培养基培养细胞,并在划痕后6、12、24、48小时观察拍照,测量划痕宽度,计算细胞迁移率,筛选出SNP最佳作用浓度及作用时间。实验数据用均数士标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,两两比较用T检验,组间比较采用单因素方差分析。以P值＜0.05为差异显著,P值＜0.01为差异非常显著,P值＞0.05为无统计学意义上的差异。后续实验中数据的统计方法与此相同。
　　 2、通过划痕实验测得10μmol/LSNP溶液为最佳浓度,培养最佳时间为24小时。据此,以细胞密度为105个/ml接种1ml至六孔板,加入含有终浓度为10μmol/LSNP溶液的无钙1640培养基培养细胞24小时后,超声裂解细胞,离心,取上清液,用Elisa试剂盒检测NO对细胞内cGMP浓度的影响。
　　 3、在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以细胞密度105个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,罗丹明一鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。
　　 4、接种细胞至六孔板,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA、总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。
　　 5、接种细胞至六孔板,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1等RhoGTP酶在mRNA水平及在蛋白水平的改变。
　　 6、增强或阻断cGMP作用后HaCat细胞功能改变
　　 通过以上实验,统计出浓度为10μmol/L的SNP对HaCat细胞的迁移能力增加最显著。在此浓度的基础上,进行划痕实验,观察各种cGMP干扰因子对NO作用的影响。根据加入的cGMP干扰因子不同,将实验分为四个组,分别为cGMP促进剂组、cGMP拮抗剂组、并设立阳性对照组及空白对照组,空白对照组不加入SNP及干扰因子,剩下的三组均加入10μmol/LSNP溶液,在此基础上,cGMP促进剂组加入50μmol/L8Br-cAMP,cGMP拮抗剂组加入8CPT cAMP,阳性对照组加入与上述两组等体积的PBS。
　　 1)迁移实验:实验分为四个组,接种细胞至12孔板,在细胞完全贴壁后进行划痕操作,在划痕后加入上述四种干扰因子,及阳性对照组、阴性对照组,24小时后测定迁移距离,计算迁移率,并将结果进行统计,具体操作同上。
　　 2)在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以浓度105个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。
　　 3)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。
　　 41接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1在mRNA水平及在蛋白水平的改变。
　　 7、增强或阻断蛋白激酶G作用后HaCat细胞功能改变。
　　 根据加入的蛋白激酶G干扰因子不同,将实验分为四个组,分别为:蛋白激酶G激动剂组、蛋白激酶G抑制剂组,并设立阳性对照组及空白对照组,空白对照组不加入SNP及干扰因子,剩下的三组均加入10μmol/LSNP溶液,在此基础上,蛋白激酶G激动剂组加入8Br cGMP;蛋白激酶G抑制剂组加入8CPT cGMP,阳性对照组加入与上述两组等体积的PBS。
　　 1)迁移实验:实验分为四个组,接种细胞至12孔板,在细胞完全贴壁后进行划痕操作,在划痕后加入上述四种干扰因子,及阳性对照组,阴性对照组,24小时后测定迁移距离,计算迁移率,并将结果进行统计,具体操作同上。
　　 2)在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以浓度105个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。
　　 3)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。
　　 4)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1在mRNA水平及在蛋白水平的改变。
　　 结论
　　 适宜浓度的外源性NO可促进培养人表皮角质成型细胞的迁移,提示其可能在皮肤创面修复起着重要作用。其作用机制可能为NO促进GTP水解生成cGMP增强,随着cGMP的增高,一方面,β1整合素表达下降,另一方面,Rho GTP酶的表达增强,引起微丝、微管向细胞边缘聚集,纤维束增粗等结构的改变,从而引起细胞的迁移能力增强。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词表

前言

材料与方法

实验结果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 NO在创面愈合中的作用

攻读硕士期间发表文章