成年豚鼠膀胱ICC上超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)电生理的初步研究

摘要

众所周知，膀胱肌组织能够产生不受神经系统控制的白发性动作电位，但目前其机制尚未明了。前期的研究中已经证实了膀胱存在ICC，简单记录了Ih电流。这些结果都不能证实ICC在膀胱中到底起到何种作用。 Ih电流(在心脏称为If电流)在胃肠道和心脏窦房结的研究中被认为是“起搏电流”，而HCN通道是Ih电流的分子基础。我们前期的系列研究中已经提示ICC上可能存在HCN通道，但是其电生理特征还尚未明确。同时，既往的实验方法中采用培养的ICC进行电生理实验，效果并不理想，其主要原因是培养后的ICC进行膜片钳实验时难度很大，而且其所测参数并不一定代表了真实生理状态下的情况。 因此本实验的目的：建立一套稳定、可靠的急性分离方法以获得活性更好的ICC；观察ICC上HCN通道的表达，完善HCN通道基本的电生理参数，为进一步的研究提供实验基础和理论依据。 主要实验结果与结论如下： 1.建立了稳定可靠的急性分离方法，所得到的细胞经免疫组织化学实验方法确认是ICC；其酶消化方案为：II型胶原蛋白酶2.0mg/ml，胰酶抑制剂2.0mg/ml，木瓜蛋白酶1.0mg/ml，BSA1.0mg/ml，其消化时间15min。 2.采用c-Kit和HCN抗原的免疫荧光双标法，证明了c-Kit阳性的ICC细胞上具有HCN通道抗原的阳性表达。 3.ICC上记录到了Ih电流，其激活电压位于-140mV～-90mV之间，电流幅度为300-800pA，具有电压依赖性，并能被ZD7288(20μM)和Cs+(500μM)阻断。 4.Ih电流反转电位42±2mV，PNa/PK为0.42，膜电容为10-40pF；胞外ZD7288阻断Ih电流具有浓度依赖性，其IC50为24.7±6.5μmol/L，且其阻断效应不可逆；胞外Cs+阻断Ih电流具有浓度依赖性，其IC50为232.5±24..8μmol/L，且其阻断效应可逆。 5.胞外钠钾对HCN通道皆有影响，具有浓度依赖性，其浓度的改变会影响HCN通道的激活和电导；胞外给予TTX、TEA及Ba2+对Ih电流无明显影响。 6.胞外钙可明显影响HCN通道的激活时间，具有浓度依赖性；胞内cAMP可影响HCN通道的激活时间，具有浓度依赖性。

目录

文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一部分 成年豚鼠膀胱ICC的急性分离和鉴定

实验一：成年豚鼠膀胱ICC的急性分离

材料与方法

结 果

实验二：成年豚鼠膀胱ICC的鉴定

一、材料

二、方法

结 果

讨 论

结论

第二部分 成年豚鼠膀胱ICC上超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)的鉴定

实验一：成年豚鼠膀胱ICC上超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)的组织蛋白学鉴定

材料与方法

结 果

实验二：成年豚鼠膀胱ICC上超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)的电生理学鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第三部分 成年豚鼠膀胱ICC上超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)的电生理特性初探

材料与方法

结 果

讨 论

结论

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述一 膀胱ICC样细胞研究进展

文献综述二 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况

英文论著一

英文论著二

英文论著三

英文论著四