血管内皮生长因子-C在大脑皮质发育障碍中的作用及机制研究

摘要

大脑皮质发育障碍(MCD)是药物难治性癫痫的重要病因之一。随着高清影像学技术的普及,MCD的临床检出率不断提高,现已证实约有40％的药物难治性癫痫是由MCD所致,而在小于3岁的儿童药物难治性癫痫病人中更高达80％,因此MCD已成为药物难治性癫痫研究领域内重点和热点的问题。MCD是一类病理学表现类似疾病的总称,主要包括结节性硬化(TSC)、局灶性皮质发育不良(FCD)、多小脑回、无脑回畸形及Sturge-Weber综合征等亚型,其中TSC和FCD是最常见的MCD亚型。尽管MCD根据不同的临床表现具有不同的分类,但都具有共同的组织病理学特点,表现为大脑皮层层状结构和柱状结构紊乱、脑回结构破坏,出现大量异形神经元(DNs)、巨形神经元(GNs)、气球样细胞(BCs)以及巨细胞(GCs)等,这些异常的细胞被称作异构神经元(MNs)。临床资料表明伴有异构神经元的MCD患者更易出现癫痫发作,早期出现耐药。因此,异构神经元在MCD的致痫性中发挥“核心作用”。目前,对异构神经元的病理发生机制尚无明确定论,较为公认的观点认为,异构神经元的产生可能是由胚胎发育期间神经元迁移,成熟和/或细胞死亡过程中出现异常所致。此外,围产期和出生后早期的脑损伤可能也参与了异构神经元的病理发生。总之,目前对MCD及异构神经元病理发生机制所知有限,对涉及其中的关键因子、信号途径仍待阐明。
　　 VEGF-C是公认的淋巴系统发生调节因子,通过激活两个特异性受体VEGFR-2,VEGFR-3发挥生物学效应,其中VEGFR-3为VEGF-C的主力型受体。在正常情况下,VEGF-C及VEGFR-3局限性表达于淋巴内皮,而它的另一受体VEGFR-2则在血管内皮和淋巴内皮上均有表达,发挥其促脉管系统发生的作用。
　　 由于脑内淋巴系统缺如,既往很少有研究关注VEGF-C在中枢神经系统的作用。直到2006年,有学者发现当小鼠敲除VEGF-C后,表达VEGFR-3受体的神经的体细胞增殖明显受阻,而且胚胎视神经中少突胶质细胞前体细胞选择性缺失,证明VEGF-C信号通路参与了中枢神经系统的生长发育、发挥神经营养功能。近两年来陆续有研究揭示了VEGF-C信号系统在神经系统中的新作用,如VEGF-C/VEGFR-3能够介导胶质前体细胞的增殖,迁移。新近报道脑缺血后,定位于海马齿状回颗粒细胞层最内侧带的细胞高度表达vEGFR-3,这些细胞同时表达与细胞迁移相关的神经前体细胞标记物PSA-NCAM,表明VEGF-C系统参与脑缺血后海马神经发生。此外,脑卒中后,患侧SVZ区内VEGFR-3的表达水平显著上调,表型鉴定实验证实绝大多数表达VEGFR-3的细胞主要为具有旺盛增殖活力的神经祖细胞,另有小部分VEGFR-3阳性细胞为具备迁徙能力的神经前体细胞。在本研究预实验中,我们发现手术切除的MCD标本中VEGF-CmRNA表达上调。那么,VEGF-C及其受体在MCD中的具体表达模式如何?是否表达于异构神经元?高表达的VEGF-C是否参与MCD所致癫痫发作?这些问题值得我们关注。
　　 为了阐明VEGF-C在MCD中的作用及其可能的机制,首先,我们利用半定量RT-PCR、western blot、免疫组织化学技术观察了VEGF-C及其受体在MCD(TSC与FCD亚型)临床标本中的表达分布情况;其次,观测了VEGF-C受体信号通路下游相关信号分子的表达活化情况;第三,观察了与VEGF-C高度同源的VEGF-D在MCD中的表达情况;最后,为了直观的了解VEGF-C对MCD致痫效应的影响,我们建立MCD大鼠模型,利用膜片钳全细胞记录技术,观察VEGF-C对MCD大鼠异构神经元兴奋性谷氨酸受体(NMDA受体)的调节效应。通过这些研究,我们得到以下结果:
　　 一、VEGF-C及其受体在MCD中的表达分布
　　 1.通过RT-PCR,western blot分析,从基因和蛋白水平证明正常皮层中不同程度地表达VEGF-C、VEGFR-2及VEGFR-3;免疫组化结果表明VEGF-C及其受体主要分布于皮层锥体神经元:
　　 2.在TSC皮层结节组织匀浆中,VEGF-C及其受体VEGFR-2、VEGFR-3的mRNA及蛋白表达水平较正常对照组明显升高。免疫组化结果显示,VEGF-C,VEGFR-2及VEGFR-3特征性的高表达于DNs、GCs及反应型胶质细胞;免疫荧光双标结果表明:①绝大多数VEGF-C免疫阳性的DNs,GCs共表达神经丝蛋白标记物NF-200;然而未见共表达与另一种神经元标记物NeuN以及星形胶质细胞特异性标志物GFAP共表达;TSC组织中可见CD68阳性的巨噬细胞浸润,但是这些细胞不表达VEGF-C;②VEGFR-2与VEGFR-3的细胞定位表达模式类似,多数VEGFR-2或VEGFR-3免疫阳性的DNs与NF-200共表达,而共表达VEGFR-2(VEGFR-3)与NF-200的GCs略少,未见VEGFR-2(VEGFR-3)免疫阳性的DNs,GCs共表达GFAP。
　　 3.在另一常见的MCD亚型-FCD中,VEGF-C及受体VEGFR-2、VEGFR-3的mRNA及蛋白表达水平较正常对照组同样显著升高。VEGF-C及其受体高表达于DNs,GNs,BCs及胶质细胞。免疫双标结果显示:①VEGF-c免疫阳性的异构神经元不表达GFAP;与TSC中表达模式不同的是,FCD中的DNs,GNs,BCs能够同时表达VEGF-C与NeuN,提示其具有成熟神经元属性。②VEGFR-3免疫阳性的异构神经元既不表达NF-200,又不表达GFAP,表明其特殊的分子表型。
　　 二、MCD病灶内VEGF-C下游相关信号通路的表达活化
　　 1.RT-PCR结果表明,MCD中Akt的基因表达上调;利用western blot观察Akt蛋白亚型表达,发现三种Akt亚型的表达均上调,其中Akt-1的表达上调最为明显,表明Akt信号通路参与了MCD的病理生理机制。
　　 2.正常皮层及MCD中均可见Bad的表达,且表达水平基本相同;然而,MCD病灶内的磷酸化Bad(p-Bad)表达显著升高,提示MCD中抗凋亡通路活化。
　　 3.ERK表达于MCD病灶组织和正常皮层中,呈现特征性的44kDa和42 kDa双条带(ERK1/2),并可见ERK1/2在MCD中的表达明显上调。
　　 三、VEGF-D在MCD中的表达分布
　　 1.正常皮层组织匀浆中,可探及VEGF-D mRNA及蛋白表达;免疫组织化学结果表明VEGF-D主要表达于锥体神经元,且免疫反应程度较轻。
　　 2.MCD组织匀浆中,VEGF-D mRNA及蛋白表达水平上调。免疫组织化学实验发现:①TSC亚型中VEGF-D表达于多数DNs、GCs及反应性胶质细胞,但免疫阳性强度不一;免疫双标未发现VEGF-D阳性异构神经元与NeuN,NF-200,GFAP及CD68共表达;②FCD亚型中可见VEGF-D表达于DNs,GNs,BCs及反应性胶质细胞,免疫双标结果表明VEGF-D免疫阳性的异构神经元不表达成神经纤维蛋白NF-200,亦不表达成熟星型胶质细胞标记物GFAP。
　　 四、VEGF-C对MCD大鼠异构神经元NMDA受体功能的调节效应
　　 1.建立MCD动物模型,制备活体脑片后进行膜片钳全细胞记录,结果表明①MCD大鼠异构神经元可产生动作电位,但动作电位形态各异,峰率适应性降低或消失,提示其电生理功能发育不完善;②异构神经元中可记录到evoked-EPSC,但电流形态明显发生改变,通道电流成分混杂,电流面积明显增加,提示MCD异构神经元突触传递效能改变;③MCD异构神经元中NMDA/AMPA受体介导电流的比率显著上调,这种比率改变主要是由NMDA受体电流成分增多引起,表明异构神经元中NMDA受体功能上调。
　　 2.MCD大鼠异构神经元中VEGF-C及其受体VEGFR-2的表达明显上调,VEGFR-3的表达办有增加。
　　 3.100gmol/L NMDA作用于异构神经元后,可诱发典型的快反应电流,经过100ng/mL VEGF-C孵育后,相同浓度NMDA诱发的电流显著增大,提示VEGF-C对NMDA受体产生协同作用;当给予VEGFR-2受体阻断剂Ki8751预处理后,这种协同效应被阻断,表明VEGF-C对NMDA受体的调节效应主要是由VEGFR-2受体介导的。
　　 综上所述,本研究结果表明:第一、人MCD组织中VEGF-C及其受体VEGFR-2,VEGFR-3表达显著上调,且特征性地高表达于异构神经元;第二、MCD中VEGF-C下游通路中抗凋亡相关信号分子激活,有益地提示VEGF-C可能通过抗凋亡相关信号通路调节MCD内异构神经元的生物学行为;第三、VEGF-D在MCD中的表达上调;第四、VEGF-C通过VEGFR-2增强MCD大鼠异构神经元NMDA受体活性,易化异构神经元的兴奋性。总之,我们的结果提示VEGF-C信号通路参与了MCD的病理生理机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

血管内皮生长因子-C在大脑皮质发育障碍中的作用及机制研究

第一部分 临床标本部分

第一节 VEGF-C及其受体在MCD中的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二节 MCD病灶内VEGF-C下游信号通路的表达活化

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三节 VEGF-D在MCD中的表达分布

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 VEGF-C对MCD大鼠异构神经元NMDA受体功能的调节效应

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

致谢

图片

文献综述一:大脑皮质发育障碍病理发生机制的研究进展

文献综述二:NeuN研究进展及其在大脑皮质发育障碍研究中的应用

学习期间发表和待发表的论文