玉竹水溶性多糖的提取动力学模型及一级结构鉴定研究

摘要

多糖具有改善免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、延缓衰老、抗感染、抗辐射等多种生理活性的发现，成为国内外制药企业在保健品和糖类药物研发的重要项目之一。玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce被我国卫生部列为药食两用品种之一，其主要成分玉竹多糖具有预防和治疗高血糖、高血脂、抗氧化、增强免疫力等活性作用。截至目前，对玉竹的研究主要集中在多糖的药理活性、传统提取工艺优化以及其他化学成分的研究，而有关玉竹多糖以动力学理论为指导的提取工艺研究，以及较为全面系统的结构鉴定尚未见报道。为进一步阐释玉竹多糖提取过程动力学与结构分析等问题，本论文共设为三部分内容，分别对玉竹多糖从提取动力学模型与动力学参数分析、分离纯化制备、一级结构鉴定进行研究，为玉竹多糖的生产应用和技术开发提供理论支撑。主要研究内容如下：
　　1、玉竹多糖的提取动力学模型研究及动力学参数分析
　　本文以Fick第二扩散定律为基础，采用球形模型假设，从数学方程角度推导提取过程动力学模型。以试验条件：温度为323K~373K、液固比为50、100、200mL·g-1、颗粒半径为177.5μm、提取时间为30~210min条件下提取玉竹多糖，测得各条件下的提取质量浓度。利用试验数据，求解4组动力学参数：速率常数k、有效扩散系数Ds、相对萃余率Y、表观活化能Ea，其回归方程相关系数R2-均为0.90以上。利用试验数据、动力学参数与上述提取过程动力学模型进行拟合，建立了玉竹多糖浸提过程动力学方程。经实验实测值与方程预算值作拟合度验证，两者不存在统计学意义（P>0.05），且相对误差绝对值均小于10％，说明该方程对玉竹多糖浸提过程动力学有较好的预测能力，可反映提取过程多糖质量浓度与提取时间、温度、液固比的关系。
　　2、玉竹多糖的分离纯化制备
　　将已干燥、粉碎、脱脂的玉竹，经热水提取、AB-8大孔树脂脱色素、Seavg法除蛋白、60%和80%乙醇分步醇沉分级、离心、冷冻干燥，得到玉竹粗多糖 POP60、POP80。本实验仅对POP60进一步纯化，先后采用阴离子交换剂DEAE-52纤维素柱色谱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱色谱对其进行纯化，透析，冷冻干燥，得到NPOP60-I以及POAP60-I两种精制玉竹多糖。经紫外光谱法和常压葡聚糖凝胶过滤法对NPOP60-I和POAP60-I进行纯度鉴定：紫外光谱分析显示NPOP60-I和POAP60-I在260-280nm处均无出现明显吸收峰，说明其不含核酸和蛋白质；常压葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线为单一对称峰型，证明NPOP60-I和POAP60-I为纯度较高的均一组分。
　　采用苯酚-硫酸法，以制备的精制玉竹多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子f为1.48，测得玉竹粗多糖部位多糖含量为89.41%，玉竹水提物中多糖含量为7.24%
　　3、玉竹多糖的一级结构鉴定
　　采用HPLC、FT-IR、NMR、GC-MS、SEM仪器技术，结合完全酸水解、PMP衍生化、甲基化反应等化学方法，对玉竹多糖的理化性质、单糖组成、糖苷键构型、主链与支链糖苷键位置、连接方式等一级结构进行深入研究，并对多糖空间表征进行分析。
　　理化性质结果为：NPOP60-I和POAP60-I经硫酸-苯酚显色反应、Molish紫环专属反应均呈阳性；菲林反应、双缩脲反应、I2-KI反应均为阴性，说明两者均为多糖组分，不含还原性糖、蛋白质、淀粉。硫酸-间羟基联苯反应结果显示POAP60-I含有糖醛酸成分。
　　高效液相色谱法分析单糖组成结果表明：NPOP60-I单糖组成及摩尔比为：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=1.00：12.07：9.55；POAP60-I单糖组成及摩尔比为：甘露糖：鼠李糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=1.00：0.82：0.22：12.61：4.87：2.23。
　　红外光谱结果表明：NPOP60-I和POAP60-I在3600-3200cm-1和3000-2800cm-1范围均出现糖类O-H和C-H特征峰，在897cm-1有β-型吡喃糖C-H特征吸收峰，说明两者均为β-型吡喃糖的糖苷构型。POAP60-I在1741cm-1处有羧基C=O非对称伸缩对称吸收峰，说明可能含有一定量的糖醛酸。
　　甲基化反应、GC-MS以及 NMR谱对其糖苷键连接方式、糖链分支情况分结果表明：NPOP60-I主链部分由葡萄糖、半乳糖和甘露糖构成，其中主要为（1→6）葡萄糖、（1→2）葡萄糖和（1→6）半乳糖连接方式存在，其末端残基为甘露糖，其摩尔比为：2.25：0.76：0.80：1.00。POAP60-I主链部分由葡萄糖、半乳糖和甘露糖构成，其中主要为（2→6）甘露糖、（1→6）葡萄糖、（1→4）葡萄糖、（1→6）半乳糖，其末端残基为葡萄糖（1→），有分支片段（1→）阿拉伯糖，半乳糖醛酸以（→6）取代形式存在，其摩尔比为：1.00：9.87：2.13：5.84：1.45：3.24：1.77。1H-NMR和13C-NMR谱结果说明，其糖苷键异头质子为β型吡喃糖构型，不含呋喃糖构型。
　　电镜扫描结果显示：NPOP60-I呈较规则片状，呈单个或聚集分布折叠近成团，说明多糖高度聚集，糖链呈平面叠加时有一定的方向性。POAP60-I主要呈纤维状，相互缠绕形成树丫状的高级空间结构，可能与多糖分子间较强的相互作用力有关，说明糖链上可能具有分支结构。

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第一章 序言

1 文献综述

2 课题研究背景、意义及研究内容

第二章 玉竹多糖提取动力学模型研究及参数分析

2.1 实验材料与仪器

2.2实验方法

2.3 结果与分析

2.4本章小结

第三章 玉竹多糖的分离纯化制备

3.1实验材料与仪器

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4本章小结

第四章 玉竹多糖的一级结构鉴定

4.1实验材料与仪器

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4本章小结

全文总结

1、玉竹多糖浸提过程动力学方程、动力学参数与适用性验证研究

2、玉竹多糖分离、纯化工艺与含量测定研究

3、玉竹多糖理化性质与结构鉴定研究

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢