左卡尼汀对高渗盐水诱导的小鼠干眼模型眼表保护作用的初步研究

摘要

背景与目的：干眼病(dry eye disease)，又称角结膜干燥症(keratoconjunctivitis sicca)或者泪液功能不全综合征(dysfunctional tear syndrome)，是指任何原因引起的泪液质和量异常或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适，导致眼表组织病变为特征的疾病总称，是最常见的眼表疾病。干眼病严重影响患者的生活质量。干眼病患者的泪液渗透压显著升高，其渗透压为(326±22.1)mOsmol/L，正常人泪液渗透压为(302±9.7)mOsmol/L。用316 mOsmol/L作为干眼病的诊断指标，其敏感性和特异性优于任何其它的干眼病诊断指标。
　　 目前干眼病的治疗以人工泪液滴眼为主，通过提高泪膜稳定性，在一定程度上能缓解干眼病患者临床症状和体征，但对中、重度干眼病的治疗效果不佳。自体血清作为有效的泪液替代物，无防腐剂、无抗原性，能促进结膜、角膜上皮增殖分化而应用于中、重度干眼病的治疗，但其保存受限。因此，从干眼病发病机制出发，研发一种有效治疗干眼病的药物并应用于临床是急待解决的问题。
　　 左卡尼汀是一种极性分子。文献证实，左卡尼汀具有渗透保护的作用。哺乳动物眼表组织中，左卡尼汀在晶状体中浓度最高，在玻璃体中浓度最低，兔的双眼局部应用左卡尼汀膏剂后，角膜中左卡尼汀含量显著增加。Pescosolido等证实人的泪液中存在左卡尼汀及其衍生物，干眼病患者泪液中左卡尼汀浓度显著下降，作者建议使用含左卡尼汀成分的滴眼液来缓解干眼病患者眼表上皮细胞的损害。研究表明，左卡尼汀对高渗(400mOsmol/L)培养基中的角膜上皮细胞具有渗透保护的作用。左卡尼汀作为生理性补充或药物在眼科的研究中证实，1%浓度为其最佳剂量。目前，局部应用左卡尼汀对干眼病角膜和结膜上皮细胞是否具有保护作用尚未见文献报道。
　　 本实验在课题组前期高渗盐水点眼制作小鼠干眼模型的基础上，初步探讨局部应用左卡尼汀是否具有减缓小鼠干眼模型眼表损害的作用。
　　 方法：
　　 1.动物的选择与分组6～8周龄雌性BALB/c小鼠60只，随机数字表法分为高渗盐水滴眼组(HO组)，高渗联合等渗盐水滴眼组(HO+IO组)，高渗盐水联合1%左卡尼汀滴眼组(HO+1%LCA组)。每组20只，双眼取用。对HO组采用500mOsmol/L氯化钠溶液滴眼，每天5次；对HO+IO组，先滴308mOsmol/L氯化钠溶液，30min后，再滴500mOsmol/L氯化钠溶液，每天各滴眼5次；对HO+1%LCA组，先滴1%左卡尼汀滴眼液，30min后，再滴500mOsmol/L氯化钠溶液，每天各滴眼5次。持续滴眼28天。
　　 2.1%左卡尼汀滴眼液的制备：左卡尼汀粉剂溶于注射用水，氯化钠粉剂调节渗透压至308mOsmol/L，盐酸调节pH值至7.0。
　　 3.泪液分泌量的测定采用SchirmerⅠ方法测定BALB/c小鼠泪液的分泌量。在裂隙灯显微镜下，使用显微镊夹住酚红棉线，放置于BALB/c小鼠眼睛的外眦部，60s后取出，用毫米刻度尺测量酚红棉线湿润的长度。
　　 4.角膜荧光素染色与评分用微量加液器在BALB/c小鼠下方结膜囊内滴入1ul5%荧光素钠溶液，3min后，裂隙显微镜下用钴蓝光进行检查，并照相记录。
　　 5.泪液蕨类实验采用自制毛细玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部泪液，涂在洁净的载玻片上，室温干燥，在48h内光学显微镜下进行蕨类结晶图像分析，并照相记录。
　　 6.角膜和结膜上皮的组织学观察采用苏木精伊红染色在光学显微镜下观察角膜上皮形态。采用图像分析软件测量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部结膜，采用过碘酸-Schiff染色，在光学显微镜下观察上方穹窿部结膜上皮的形态。计算每个高倍视野下杯状细胞数量。
　　 7.扫描电子显微镜观察第28天在扫描电子显微镜下观察角膜上皮表面的形态。
　　 8.泪液渗透压测定首先建立BALB/c小鼠泪液渗透压测定值转化表。在实验第0、28天收集小鼠泪液，冰点渗透压仪测定泪液渗透压值，依据建立的BALB/c小鼠泪液渗透压测定值转化表进行泪液渗透压的换算。
　　 9.统计学分析方法采用Kruskal-Wallis H检验比较角膜荧光素染色评分。采用完全随机设计资料的方差分析和LSD-t比较中央角膜上皮厚度、泪液的分泌量、杯状细胞数量、泪液渗透压值。
　　 结果：
　　 1.泪液分泌量的测定第0、7天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组的酚红棉线浸湿长度的差异无统计学意义(P>0.05)。第14、28天，三组的酚红棉线浸湿长度的差异出现统计学意义(P<0.05)，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组酚红棉线浸湿长度显著性下降，而HO组与HO+IO组两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 2.角膜荧光素染色与评分第0天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组角膜上皮荧光素染色均有少许点状着色，三组之间角膜荧光素染色评分差异无统计学意义(P>0.05)。随着实验进展，HO组、HO+IO组角膜鼻侧象限点状着色增加，渐呈现片状着色，病变逐渐发展累及角膜各个象限，以角膜中央为重。第14天起，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组角膜荧光染色评分显著上升。第14、28天，三组之间角膜荧光素染色评分出现显著性差异(P<0.01)。
　　 3.泪液蕨类实验第0天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组BALB/c小鼠泪液在光学显微镜下可以观察到形态良好的蕨类物。HO组、HO+IO组BALB/c小鼠泪液的结晶中蕨类物自第7天起逐渐减少，蕨类物之间的连接中断。而同一时间点，HO+1%LCA组较HO组、HO+IO组蕨类物形态保持良好。
　　 4.角膜上皮的HE染色观察和角膜上皮厚度的测量第0天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组角膜HE染色观察可见上皮分层良好，分4或5层，基底部的细胞呈柱状排列，向角膜表层分化逐渐变成鳞状上皮细胞，三组之间中央角膜厚度测量值无统计学差异(P>0.05)。随实验进展，HO组、HO+IO组角膜上皮表层细胞出现增生，细胞层数增多，角膜上皮厚度增加。第7天起，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组三组之间中央角膜上皮厚度测量值出现显著性差异(P<0.01)。第7、14、28天，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组中央角膜上皮层厚度明显增加。
　　 5.结膜组织的PAS染色观察和杯状细胞计数第0天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组结膜上穹窿部包含多层上皮细胞，形态呈圆柱状或骰状，杯状细胞广泛分布于穹窿部上皮细胞之间，三组之间结膜杯状细胞计数差异无统计学意义(P=0.538)。随实验进展，HO组、HO+IO组结膜上穹窿部上皮细胞排列紊乱，出现缺失，杯状细胞形态不一致，数量减少。第7天起，三组之间杯状细胞数量出现显著性差异(P<0.01)。第7、14、28天，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组杯状细胞数量明显减少，出现显著性差异，而HO组与HO+IO组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 6.扫描电子显微镜观察第0天，角膜表面上皮细胞的扫描电子显微镜观察可见，上皮细胞呈多边形，形态良好，细胞表面可见大量微绒毛，细胞间紧密连接。第28天，HO组、HO+IO组绝大多数角膜表层细胞脱落，暴露第二层细胞，显露膨胀的细胞核，微绒毛大量的脱落。第28天，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组角膜表面微绒毛明显减少。
　　 7.泪液渗透压测定建立BALB/c小鼠泪液渗透压测定值转化表。实验第0天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组三组之间泪液渗透压测定值差异无统计学意义(P=0.712)。第28天，HO组、HO+IO组、HO+1%LCA组三组之间泪液渗透压测定值出现显著性差异(P=0.000)，HO组、HO+IO组较HO+1%LCA组泪液渗透压值升高，出现显著性差异，而HO组与HO+IO组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.局部应用左卡尼汀具有减缓小鼠干眼模型眼表损害的作用。
　　 2.左卡尼汀可能通过渗透调节作用，对高渗盐水诱导的小鼠干眼模型眼表起保护作用。
　　 3.局部应用含左卡尼汀及其衍生物的滴眼液可能具有临床治疗干眼病的作用，值得进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词一览表

前 言

第一部分 左卡尼汀对小鼠干眼模型眼表保护作用的眼部体征观察及相关指标研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 左卡尼汀对小鼠干眼模型眼表保护作用的组织病理学的初步研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

创新性

致谢

照 片

参考文献

文献综述 左卡尼汀及其衍生物在眼科疾病发病中保护作用的研究进展

参考文献

研究生期间发表论文