线粒体转录因子A对肝外胆汁淤积肝细胞mtDNA氧化损伤的保护作用及机制研究

摘要

一、研究背景与目的
　　 肝外胆汁淤积常由于一些恶性肿瘤、肝外胆管结石阻塞胆管或先天胆道闭锁导致胆汁流出受阻，胆汁积聚肝内，疏水性的胆汁酸引起肝细胞凋亡和坏死，最后可导致肝纤维化和肝硬化。对一些胆管阻塞时间长，黄疸程度深的患者，不仅手术耐受能力低，即使胆道梗阻解除了，术后肝功能仍然恢复慢，甚至出现肝功能进一步损害，造成临床治疗失败。
　　 因此，胆汁淤积如何引起肝脏功能损害，一直是国内外学者关注的热点。氧化应激和线粒体功能障碍涉及到慢性肝脏胆汁淤积的发病机制，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)对氧化应激高度敏感，极易发生氧化损伤。一旦mtDNA损伤超过某个阈值，mtDNA通过其编码的呼吸链亚基对氧化应激具有放大作用，这样会加重线粒体的氧化损伤直至细胞死亡。线粒体转录因子A(TFAM)具有结合和缠绕mtDNA及解螺旋能力，对维持mtDNA空间构想，调节mtDNA的复制和转录及损伤修复具有重要作用。基于以上研究背景，本课题拟研究肝外胆汁淤积患者肝损伤与肝mtDNA改变的关系，探讨线粒体转录因子A在肝外胆汁淤积中的表达及其对肝细胞mtDNA的保护作用，从而达到保护和改善胆汁淤积患者肝功能的目的。
　　 二、材料与方法
　　 1.病例标本与细胞系：严格按照入组条件选择12个梗阻性黄疸患者，其中胰腺癌6例，壶腹周围癌4例，胆管癌2例。10个非梗阻性黄疸患者为对照组，其中胰腺癌4例，胆囊结石6例。两组患者在年龄、性别上无统计学差异，所有病例排除病毒性肝炎感染、肝自身免疫性疾病或代谢性疾病；未用过有肝脏毒性的药物；有酒精肝患者也被排除。术中肝组织标本获取过程一致，排除肝门阻断对mtDNA的影响。切取的肝组织标本迅速浸泡于液氮罐中，并保存在-80℃冰箱中。人正常肝细胞株L02购于中国科学院上海细胞所。
　　 2.HE染色观察病例标本肝脏组织病理变化；试剂盒检测氧化损伤指标MDA、8-OHdG改变及线粒体功能指标ATP含量的变化；实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(anti-DNA)的改变。
　　 3.甘氨酸鹅去氧胆酸(GCDCA)处理L02细胞模拟胆汁淤积体外模型，试剂盒检测L02细胞线粒体氧化指标ROS、8-OHdG改变、细胞活性和线粒体膜电位、ATP含量的变化；实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。
　　 4.用实时荧光定量PCR和western-blot检测肝外胆汁淤积患者及GCDCA处理L02细胞后TFAM mRNA和蛋白水平的变化。
　　 5.利用重组质粒pEGFP-N1-TFAM、pEGFP-N1-△ C-TFAM及pEGFP-N1对照，过表达TFAM或△C-TFAM后，观察其对GCDCA处理L02细胞mtDNA的拷贝数及转录水平mtRNA的影响；观察过表达TFAM或△C-TFAM后对肝细胞线粒体功能的改变；免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。
　　 三、结果
　　 1.肝外胆汁淤积患者HE：肝索结构紊乱，肝细胞胞浆内胆色素沉积，肝细胞轮廓不清，肿胀，变性坏死，可见空泡样变；肝血窦扩张，胆小管扩张，内见胆汁淤积，
　　 小叶内见大量炎性细胞浸润。与对照组相比，肝外胆汁淤积患者MDA升高4倍，ATP生成减少37％，肝组织线粒体内8-OHdG定量检测升高9.9倍(p<0.01)。免疫荧光检测胆汁淤积患者肝细胞mtDNA均发现有明显的氧化损伤，而对照组未发现有氧化损伤。实时定量PCR显示胆汁淤积患者肝组织mtDNA拷贝数较对照组下降了60％(p<0.01)，代表mtDNA编码基因转录水平COX1，ND1和ND6均有明显下降(p<0.05)，免疫荧光检测肝外胆汁淤积患者mtDNA核样结构明显减少。
　　 2.GCDCA处理L02细胞后，随着GCDCA浓度增加，L02细胞线粒体氧化指标ROS含量、8-OHdG水平逐渐增加；肝细胞mtDNA拷贝数及转录水平mtRNA逐渐减少；线粒体功能(CCK-8、膜电位、ATP含量)下降。免疫细胞荧光显示随着GCDCA浓度增加肝细胞内8-OHdG含量逐渐增加而mtDNA核样结构逐渐减少。
　　 3.实时定量荧光PCR显示肝外胆汁淤积患者TFAM mRNA表达较对照组明显减少，在GCDCA(50，75，100μ M)处理L02细胞6小时后TFAM mRNA表达较对照组分别下降了27％，32％和60％(p<0.05)；Western-blot结果显示，肝外胆汁淤积患者TFAM蛋白表达较对照组明显减少；与对照组相比，GCDCA250M处理L02细胞6小时后，TFAM蛋白表达无明显变化，但随着GCDCA浓度加大(50，75，100μM)，TFAM蛋白表达逐渐减少，100μ M时达最低。
　　 4.过表达TFAM后，GCDCA处理的L02细胞mtDNA拷贝数增加及转录水平恢复，肝细胞活力和线粒体功能(膜电位、ATP含量)得到改善。免疫细胞荧光显示肝细胞内8-OHdG含量逐渐下降而mtDNA核样结构逐渐增加。而过表达△C-TFAM，由于敲除了TFAM蛋白中具有转录活性的C末端，仅保留其维持mtDNA核样结构和维持拷贝数的功能，故其对肝细胞线粒体功能的改善程度较野生型差。
　　 四、结论
　　 1.肝mtDNA氧化损伤参与了肝外胆汁淤积患者肝细胞功能损害。
　　 2.肝mtDNA损伤归因于线粒体转录因子A的缺失。
　　 3.在胆汁淤积进程中，过表达TFAM能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用。其作用机制在于TFAM在维持mtDNA结构和功能方面的复合作用。
　　 4.过表达AC-TFAM也能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用，但较野生型TFAM作用弱。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 肝外胆汁淤积对肝脏线粒体DNA(mtDNA)氧化损伤及线粒体功能的影响

实验一 肝外胆汁淤积患者肝mtDNA氧化损伤及线粒体功能的影响

材料与设备

方法与步骤

结 果

实验二 GCDCA对肝L02细胞mtDNA氧化损伤及线粒体功能的影响

材料与设备

方法和步骤

结 果

讨 论

结 论

第二部分 线粒体转录因子A在肝细胞mtDNA氧化损伤中的保护作用及其机制研究

实验一 线粒体转录因子A在肝外胆汁淤积肝脏及肝细胞中的表达

材料与设备

方法与步骤

结 果

实验二 TFAM过表达对GCDCA处理的L02细胞mtDNA氧化损伤的保护作用

材料与设备

方法与步骤

结 果

讨 论

结 论

全文总结

致谢

文献综述 线粒体转录因子A调控mtDNA转录起始、维持mtDNA拷贝数及核样结构

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文