HIV-1 Tat49-57/HPV16 E749-57融合肽纳米颗粒疫苗的设计及作用研究

摘要

一、背景
　　 性传播疾病(sexually transmitted diseases，STDs)的发病率逐年增加，发展中国家更显著，生殖道感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)亦呈上升趋势。更为重要的是，现在研究已证明HPV是宫颈癌及其前期损害(宫颈上皮内瘤变，CIN)的主要病因，99.7%的宫颈癌可检测到HPV DNA。HPV16是宫颈癌的最常见型别，约占宫颈癌的50%。HPV16 E7癌基因的持续表达是导致宫颈上皮细胞发生转化、具有永生化特性的关键因素。因此，HPV16 E7成为控制HPV感染和HPV相关疾病的HPV疫苗及免疫治疗的理想靶蛋白。HPV16 E7的多肽疫苗可以诱导有效的T细胞反应，但由于单纯的表位肽分子量小、易降解、提呈效率低，与MHC分子亲和力低等原因，导致其免疫原性弱，临床效果不尽人意。因此，仍需探索新型的多肽疫苗形式以提高其对HPV16相关肿瘤的免疫原性，为基于表位的宫颈癌疫苗潜在临床应用提供实验基础。
　　 二、目的
　　 本研究结合表位多肽疫苗设计和基因治疗领域中阳离子肽类DNA转运载体(cationic peptides DNA delivery systems)的研究进展，提出一种新型纳米颗粒疫苗设计方案。其中阳离子肽选用细胞穿膜肽(CPP)HIV-1 Tat49-57，它具有细胞穿透功能，可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间/内的传输；选用GM-CSF质粒作为佐剂，可以刺激巨噬细胞分化、增殖和活化，亦可促进抗原递呈细胞(APC)的活化；将HIV-1 Tat49-57与CTL表位肽HPV16 E749-57融合后，可通过与富含负电荷的GM-CSF质粒DNA之间的电性中和作用发生聚合、压缩，从而形成几十纳米的致密颗粒，使之易于被真核细胞摄入并保护DNA免于核酸酶的降解，如此达到基因转染的目的。
　　 简言之，本研究拟构建一种新型的HPV16多肽疫苗，通过化学合成细胞穿膜肽HIV-1 Tat49-57与HPV16 E749-57 CTL表位肽融合多肽，并通过静电引力作用与带负电荷的pORF9-mGMCSF质粒形成复合物并自组装成纳米颗粒。体内外探讨该新型疫苗是否能提高免疫学应答和抗肿瘤效应，同时，探讨这种作用的分子机制。
　　 三、方法
　　 1.合成Tat49-57-HPV16 E749-57融合肽，并利用富含正电荷的Tat49-57与表达mGM-CSF的DNA质粒通过静电引力作用自组装成纳米颗粒，并通过凝胶阻滞实验、DNaseⅠ保护实验、透射电镜和粒度分析等方法对纳米颗粒进行鉴定；通过免疫组化及Western-blot方法检测该纳米颗粒能否将外源基因转入哺乳动物细胞并在动物活体内正确表达。
　　 2.通过CCK-8淋巴细胞增殖实验、细胞内染色及流式细胞术(FCM)、ELISPOT实验、体外特异性细胞毒CTL-LDH释放实验、CFSE体内细胞毒实验分析疫苗诱导的短期及记忆性免疫应答和其介导的CTL毒性效应。
　　 3.构建预防性及治疗性肿瘤动物模型，观察Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗在动物模型体内的短期及记忆性抗瘤效应；最后，通过对CD4 KO和CD8 KO小鼠的预防性研究，分析该纳米颗粒疫苗所诱导的CTL反应是否为CD8依赖性。
　　 四、结果
　　 1.成功构建Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒，确定最适多肽/DNA电荷比r=2.0；当r=2.0时所制备的颗粒为类圆形，大小均匀一致，绝大部分颗粒直径均分布于20-80nm之间；该纳米颗粒可将mGM-CSF基因导入哺乳动物细胞，并可在体外培养细胞和小鼠体内正确表达。
　　 2.该纳米颗粒疫苗在体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性，可诱导T淋巴细胞增殖、分化，显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应。
　　 3.该纳米颗粒疫苗能有效保护C57BL/6小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击，并且能够明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，延长其存活时间，提高存活率。
　　 4.该纳米颗粒疫苗显著提高CD8+记忆性T淋巴细胞产生，从而诱导长期的CTL应答。
　　 5.Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗产生的CTL免疫反应是CD8依赖性的。
　　 五、结论
　　 综上分析，我们在本研究中设计并合成的Tat-E7/pGM-CSF融合性纳米颗粒疫苗通过体外免疫学研究和动物模型的在体抗肿瘤研究证实了其具有良好效果，其机制可能是该颗粒疫苗的免疫可以维持高水平的特异性CD8+记忆T细胞。因此，该疫苗为一种新颖的可提高宫颈癌多肽疫苗免疫原性的疫苗形式，也可为其他病毒相关疾病和特异性肿瘤免疫治疗疫苗的研制提供新的参考。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一章 HIV-1 TAT49-57/HPV16 E749-57融合肽纳米颗粒疫苗的设计、制备及鉴定

第一节 Tat49-57/HPV16 E749-57融合肽纳米颗粒疫苗的制备

实验材料及仪器

实验方法

实验结果

第二节 Fat49-57/HPV16 E749-57融合肽纳米颗粒疫苗表达mGM-CSF的检测

实验材料及仪器

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第二章 HIV-1 TAT49-57/HPV16 E749-57融合肽纳米颗粒疫苗体内免疫效应研究

第一节 Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗诱导产生特异性CTL效应研究

实验材料及仪器

实验方法

实验结果

第二节 Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗诱导产生记忆性免疫应答研究

实验材料及仪器

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第三章 TAT-E7/PGM-CSF纳米颗粒疫苗抗肿瘤效应的在体研究

实验材料及仪器

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

全文总结

致谢

参考文献

文献综述一 宫颈癌疫苗的现状和前景

参考文献

文献综述二 HPV逃避宫颈癌宿主免疫应答的机制

参考文献

博士期间发表的文章