候选信号通路基因多态性及GWAS鉴定位点与乳腺癌易感性的分子流行病学研究

摘要

随着生活节奏的加快和生活方式的改变，以及环境污染和职业暴露等危险因素，癌症所带来的危害日趋严重。其中，乳腺癌在世界范围内女性中排名首位的致病致死肿瘤。在成年女性人群中，它的发病率是结直肠癌和宫颈癌发病率的两倍。据统计，每年大约有138万人被诊断为乳腺癌(约占每年女性新发肿瘤病例的23％)，45.8万人死于乳腺癌，占女性恶性肿瘤死亡人数的13.7％，而大约有一半的新发病例和60％的死亡病例发生在经济发展中国家。近年来，我国乳腺癌发病率逐年升高，且发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁女性身心健康。因此，确定乳腺癌的病因，从而建立起有效的预防、诊断及治疗方法，是目前迫切需要解决的问题。
　　 乳腺癌是由环境因素和遗传因素共同作用引起的多因素复杂疾病。遗传因素能解释乳腺癌约27％的病因，目前已经确定的遗传因素包括4个罕见高外显基因fBRCA1、BRCA2、TP53和PTEN)和四个罕见中度外显基因(CHEK2、ATM、BRIP1和PALB2)，以及全基因组关联研究所鉴定的52个常见低外显的SNP位点(位于35个独立loci)，然而，这些基因仅能解释遗传因素的30％左右，仍然有大部分的乳腺癌易感基因有待进一步探索研究。基于转化生长因子β信号通路(TGF-βsignaling pathway)广泛参与调节调节细胞的分化增殖、生长、凋亡、迁移、以及内环境稳定等，与乳腺癌的发生发展机制密切相关；卵巢癌与乳腺癌同为激素代谢相关肿瘤，存在相似的病因学基础，例如BRCA1和BRCA2基因是目前已经证实的二者共享的易感基因；高脂血症与包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发病风险密切相关，并且胆固醇是合成包括性激素在内的类固醇激素的前体，而内源性性激素的水平与乳腺癌的发病风险密切相关。全面评估TGF-β信号通路基因多态性、卵巢癌和血脂性状全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌易感性是否存在关联，对了解他们之间的联系，阐明乳腺癌发病机制具有重要意义。
　　 第一章 TGF-β信号通路基因多态性与乳腺癌遗传易感性关联研究
　　 目的：转化生长因子β信号通路广泛参与调节细胞的分化增殖、生长、凋亡、迁移、以及内环境稳定等，与肿瘤的发生发展密切相关。本课题部分全面研究TGF-β信号通路基因遗传变异和乳腺癌遗传易感性的关联性，了解它们在乳腺癌致癌过程中的重要作用。
　　 对象和方法：研究对象和资料来源于10个亚洲女性人群研究：上海乳腺癌病例对照研究、上海乳腺癌生存预后研究、上海子宫内膜癌病例对照研究、上海女性健康队列研究、香港乳腺癌病例对照研究、台湾乳腺癌病例对照研究、南京乳腺癌病例对照研究、广州乳腺癌病例对照研究、日本名古屋HERPACC-Ⅱ研究和日本长野乳腺癌病例对照研究。研究方案得到了伦理委员会的批准，并且所有研究对象均签署了知情同意书。为了提高结果的准确性和可靠性，研究方法采用三阶段病例对照研究设计：第一阶段对341个来自TGFB1，TGFB2，TGFB3，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMAD7和SARA基因的常见遗传变异进行研究；第二阶段从对第一阶段发现的19个显著的基因座中，每个基因座选择一个SNP纳入研究；第三阶段中对TGFBR2 rs1078985在7个独立研究中(15279个研究对象，包括7，552例病例和7，727例对照)进行了重复。实验操作人员对样本进行盲法操作，要求SNP的检出率以及平板内、不同平板间重复标本的一致率均达到95％以上；应用非条件Logistic回归模型，分别计算三种遗传模型(加性、显性和隐性遗传模型)的比值比和95％可信区间；并分别进行基础校正(年龄)和其他因素校正，包括教育水平，月经初潮年龄，绝经年龄，头胎年龄，月经状态，激素替代疗法(HRT)，纤维瘤史，家族史，体力活动，BMI和WHR；并进行了分层和交互作用分析；单体型分析采用HAPSTAT软件进行分析。
　　 结果和结论：位于TGFBR2基因内含子3的SNP rs1078985在三个阶段中(共12004例乳腺癌病例和11789例健康对照)具有均一致的关联结果，整合分析显示与AA/AG基因型相比，GG基因型明显降低乳腺癌危险性(OR：0.76，95％CI：0.65-0.89，P value=8.42×10-4)，交互作用分析显示rs1078985与乳腺癌家族史存在显著交互作用(P=0.0069)，这是至今为止乳腺癌候选基因研究中鉴定出的最显著的隐性遗传模型SNP；生物信息学分析也同样支持TGFBR2 rs1078985在乳腺癌致癌过程中的重要功能。另外TGFB2 rs2799086，TGFB2 rs17047740，TGFBR1 rs2026811，TGFBR1rs10733710，TGFBR2 rs304822，TGFBR3 rs284185，和SMAD3 rs7178117在前两阶段的研究中，也与乳腺癌的易感性显著关联。以上研究结果进一步证实了TGF-β信号通路在乳腺癌致癌过程中的重要作用。
　　 第二章全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌易感性关联研究
　　 第一节卵巢癌全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌易感性关联研究
　　 目的：乳腺癌和卵巢癌同为激素代谢相关肿瘤，存在相似的病因学基础，例如BRCA1和BRCA2基因是目前已经证实的二者共享的易感基因。全面研究卵巢癌全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌是否存在关联，对了解二者之间的联系，阐明乳腺癌发病机制具有重要意义。
　　 对象和方法：在5242例来自上海乳腺癌病例对照研究、上海乳腺癌生存预后研究、上海女性健康队列研究的女性受试对象中(2918例乳腺癌病例和2324例健康对照者)，我们分析了来自5个独立基因座的103个卵巢癌GWAS鉴定位点与乳腺癌易感性的关联性。研究方案得到了伦理委员会的批准，并且所有研究对象均签署了知情同意书。基因分型采用Affymetrix Genome-Wide SNP Array6.0(Affymetrix Inc。Santa Clara，CA)平台，缺失SNP采用MACH1.0软件进行imputation。质量控制要求实验操作人员对样本进行盲法操作，要求SNP的检出率以及平板内、不同平板间重复标本的一致率均达到95％以上；imputation数据要求r2>0.3。统计分析采用SAS版本9.2进行分析，应用非条件Logistic回归模型，分别计算基因分型数据或者imputation数据每单位改变的比值比(Odds ratio，OR)和95％可信区间(Confidenceinterval，CI)，并分别进行基础校正(年龄和教育水平)和其他因素校正，包括月经初潮年龄，绝经年龄，头胎年龄，月经状态，激素替代疗法(HRT)，纤维瘤史，家族史，体力活动，BMI和WHR；对绝经状态、ER，PR、肿瘤分期、BMI、WHR和月经初潮年龄等进行了分层分析，利用单纯病例研究、似然比检验进行交互作用分析。
　　 结果和结论：在整体分析中，103个位点与乳腺癌的关联结果均无统计学意义；分层分析显示，在月经初潮年龄早于14.7的人群中，基因座2中的rs717852，rs2857540，rs1318778，rs2072590，rs711830明显增加乳腺癌易感性和在WHR小于0.82的人群中，基因座7中的rs7206951明显增加乳腺癌易感性，经Bonferroni校正法进行多重校正后，结果仍然显著。其中，基因座2中的5个SNP与月经初潮年龄存在显著交互作用。以上结果提示乳腺癌和卵巢癌可能存在共享的病因学基础。
　　 第二节血脂性状全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌易感性关联研究
　　 目的：高脂血症与包括乳腺癌、结直肠癌、胆管癌和前列腺癌在内的多种肿瘤的发病风险密切相关，并且胆固醇是合成包括性激素在内的类固醇激素的前体，而内源性性激素的水平与乳腺癌的发病风险密切相关。研究血脂性状全基因组关联研究鉴定位点与乳腺癌易感性是否存在关联，对了解他们之间的联系，阐明乳腺癌发病机制具有重要意义。
　　 对象和方法：研究对象为来自美国田纳西州首府Nashville的2799例欧裔白人女性(包括1514例乳腺癌病例和1285例健康对照者)，病例的纳入标准：(1)病理确诊的乳腺癌新发病例，年龄25.75岁；(2)无肿瘤病史；(3)同意参加本研究，本签署知情同意书。对照的纳入标准：(1)无肿瘤病史；(2)对种族、居住地和年龄进行频数匹配。研究方案得到了伦理委员会的批准，并且所有研究对象均签署了知情同意书。基因分型采用Illumina公司的TruSeq基因芯片；应用非条件Logistic回归模型，分析163个血脂性状TG，LDL-C，HDL-C和TC的GWAS鉴定位点(位于104个独立基因座)与乳腺癌易感性的关系，并通过构建遗传分值评估多个位点的累积效应；利用单纯病例研究、似然比检验进行交互作用分析。
　　 结果和结论：8个独立SNP(rs2652834，rs6450176，rs2142672，rs10128711，rs3177928，rs6756629，rs2068888和rs10195252)与乳腺癌易感性密切相关，并且方向与我们的科学假设一致，其中，rs10128711和rs2142672存在边缘性的交互作用(P=0.056)。各遗传分值与乳腺癌易感性的关联均无统计学意义，我们发现GRSHDL-C与乳腺癌家族史存在交互作用(P=0.023)。研究结论有待采用孟德尔随机化方法在大样本人群中的进一步证实。