磷脂爬行酶1在结直肠癌组织中的表达及其生物学功能的研究

摘要

磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是一种Ca2+结合的Ⅱ型膜蛋白。最初的研究认为，PLSCR1的主要功能是参与在细胞激活、损伤或者凋亡过程中发生的膜磷脂重新分布。但近来发现，PLSCR1的生物学功能并不局限于细胞膜磷脂跨膜活动，甚至有研究显示PLSCR1与磷脂跨膜活动并没有充分或者必要的联系。尽管PLSCR1确切的生物学功能目前尚不明确，但是有越来越多的证据表明，PLSCR1可能参与细胞的增殖、分化和凋亡过程，并在信号传递中发挥重要作用。在结直肠腺癌组织中，有报道PLSCR1的表达水平高于正常肠粘膜，此外，与健康个体相比，早期和进展期结直肠癌患者血浆中PLSCR1水平明显升高，且早期患者升高更明显，COX回归模型显示PLSCR1高表达提示患者预后较差，但其具体作用机制尚不明确。因此，本研究对磷脂爬行酶1在结直肠癌组织中的表达及其生物学功能进行了研究。
　　目的:探讨PLSCR1的表达与结直肠癌生物学行为及预后的关系，研究沉默PLSCR1的基因对结直肠癌细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等行为的影响，探讨通过PLSCR1靶点对裸鼠移植瘤增殖和侵袭的抑制作用及其机制。期望通过以上实验，为结直肠癌的发生、发展提供预测指标及潜在治疗靶点。
　　方法:
　　1.应用免疫荧光细胞化学方法分析PLSCR1在结直肠癌细胞株中的表达情况，同时应用免疫组织化学方法分别检测结直肠癌及其肝转移癌组织中PLSCR1蛋白的表达，分析其与结直肠癌临床病理参数的关系。
　　2.使用Western-blot和反转录PCR方法从蛋白和基因水平检测PLSCR1在结直肠癌组织中的表达情况，复苏冻存的PLSCR1蛋白和基因水平表达相对较高的和相对较低的结直肠癌组织进行原代细胞培养，使用细胞侵袭实验(Transwell)方法检测PLSCR1表达差异明显的结直肠癌原代细胞的侵袭能力。
　　3.设计三条RNA干扰片段及一条阴性对照片段，稳定转染高表达PLSCR1的结直肠癌细胞株，采用Western-blot和实时定量PCR方法验证干扰结果，筛选出对PLSCR1蛋白抑制率最高的干扰片段，通过细胞粘附实验来评估转染后结直肠癌细胞粘附能力的变化，通过迁移和侵袭实验来评估转染后结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化。
　　4.建立荷瘤动物模型，通过siRNA瘤内及瘤周注射的方法研究抑制肿瘤细胞增殖效应的在体实验，探讨PLSCR1对裸鼠移植瘤增殖和侵袭的抑制作用及其机制。
　　结果:
　　1.免疫荧光细胞化学检测显示:PLSCR1在所培养的4株结直肠癌细胞株中均有表达，主要定位在结直肠癌细胞的细胞膜上，其中细胞株Lovo和HR8348表达相对细胞株Colo-320和Sw620更强。免疫组织化学方法检测显示:PLSCR1在结直肠癌和肝转移癌组织中的表达率显著高于正常粘膜。PLSCR1阳性表达与远处转移相关，PLSCR1表达阳性者术后5年生存率相对较低。
　　2.复苏人结直肠癌冻存组织进行原代细胞培养可以得到存活的肿瘤细胞用于临床科学研究。Western-blot显示:PLSCR1蛋白在结直肠癌原发灶中的表达水平显著高于正常结直肠黏膜标本。反转录PCR显示:PLSCR1mRNA的相对含量在结直肠癌原发灶中的水平显著高于正常结直肠黏膜标本。细胞侵袭实验(Transwell)检测发现，分化程度相仿，PLSCR1表达较高的结直肠癌原代细胞穿膜细胞数显著高于PLSCR1表达相对较低的结直肠癌原代细胞。
　　3.体外构建的3对RNA干扰片段siRNA/390、siRNA/851、siRNA/911均可抑制PLSCR1蛋白的表达，验证实验显示，siRNA/390干扰片段抑制效果最明显。进一步实验表明，siRNA/390干扰下调PLSCR1的表达后，结直肠癌细胞株Lovo增殖变缓，粘附、迁移、侵袭能力下降。
　　4.成功建立了结直肠癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。局部多点瘤内及瘤周注射PLSCR1siRNA-LipofectamineTM2000复合物可显著抑制裸鼠移植瘤的增殖和侵袭。对移植瘤进行免疫组织化学方法检测显示:PLSCR1及EGFR蛋白的表达均显著下降。
　　结论:
　　1.PLSCR1可能是结直肠癌基因治疗的潜在靶点。
　　2.PLSCR1siRNA可能通过下调EGFR的表达，进而抑制其信号传递通路来发挥其抗肿瘤作用。

目录

声明

英文缩写词一览表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景及意义

1．3 研究内容及方法

第二章 磷脂爬行酶1在结直肠癌中的表达及其意义

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 PLSCR1表达差异的结直肠癌原代细胞侵袭能力检测

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 沉默PLSCR1基因的表达对结直肠癌细胞粘附、迁移和侵袭的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 RNA干扰PLSCR1基因治疗结直肠癌的体内实验研究

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 结论

全文总结

参考文献

文献综述一 PLSCR1蛋白及其生物学功能的研究进展

文献综述二 晚期结直肠癌的治疗进展

附录

攻读博士学位期间研究成果

致谢