溶酶体膜蛋白-2抗体促发中性粒细胞胞外捕网形成在ANCA相关性血管炎中的分子机制

摘要

背景与目的:
　　ANCA(anti-neutrophilcytoplasmicantibody,抗中性粒细胞胞浆抗体)相关性血管炎(ANCA-associatedvasculitis,AAV)是以中性粒细胞异常死亡,导致血管发生坏死性炎症的自身免疫疾病。肾脏最常受累,表现为PiCGN(pauci-immunecrescenticglomerulonephritis,寡免疫复合物新月体肾炎),病情进展凶险,可导致迅速进展、不可逆转的肾功能衰竭。
　　ANCA不仅作为AAV诊断及活动性监测的标志,而且可作用于中性粒细胞,导致中性粒细胞异常活化及凋亡延迟,在AAV发病中起关键作用。LAMP-2(lysosomalmembraneprotein-2,溶酶体膜蛋白-2)抗体是最近才发现的ANCA新亚型,比传统ANCA具有更高的敏感性和与肾脏损害的相关性。但LAMP-2抗体的致病机理依然不清。NETs(neutrophilextracellulartraps,中性粒细胞胞外捕网)是以释放染色质纤维及大量杀菌酶为特征的中性粒细胞新的死亡方式,直接与炎症及自身免疫相关。
　　本研究拟检测LAMP-2抗体阳性AAV患者外周血及肾组织中是否存在大量NETs形成的组分,并在体外探讨LAMP-2抗体促发中性粒细胞异常死亡的可能机制,为LAMP-2抗体促发NETs形成参与AAV发病提供依据。
　　方法:
　　1.临床上收集5名LAMP-2抗体阳性AAV患者外周静脉血及肾活检标本,采用PolymorphprepTM密度梯度离心法分离患者及健康志愿者外周静脉血中性粒细胞,FITC-CD16抗体标记,流式分析鉴定其纯度,免疫荧光标记NETs及自身抗原LAMP-2、PR3、MPO的表达,了解AAV患者外周血及肾脏是否出现NETs形成。
　　2.分离健康人外周静脉血中性粒细胞,体外LAMP-2抗体刺激中性粒细胞,通过AnnexinV–AlexaFluor488凋亡试剂盒及流式细胞术检测中性粒细胞凋亡状态,透射电镜检测自噬小体,Westernblot检测自噬相关蛋白Beclin-1的表达及LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转换,扫描电镜及免疫荧光观察NETs形成;活细胞成像观察LAMP-2抗体促发NETs形成,并进一步通过特异性阻断剂Z-vad-fmk、Nec-1、3MA及DPI分别阻断凋亡、坏死、自噬及活性氧簇的产生,体外探讨LAMP-2抗体促中性粒细胞异常死亡的可能机制。
　　结果:
　　1.通过CD16抗体标记及FACS分析,获得了纯度大于95％的中性粒细胞,DAPI标记鉴定呈现为中性粒细胞特有的分叶核结构。
　　2.AAV患者外周血中NETs形成数量明显高于健康志愿者(P=0.0014)。
　　3.AAV患者肾小球及间质内有大量DNA、组蛋白及ANCA靶抗原LAMP-2、PR3、MPO组成的NETs组分沉积。
　　4.LAMP-2抗体处理中性粒细胞24h后,凋亡率较对照组明显降低(P<0.0001)。
　　5.LAMP-2抗体作用中性粒细胞30min时胞浆内出现大量未成熟的自噬小体,Beclin-1的表达较对照组明显升高(P=0.0150),LC3Ⅰ显著向LC3Ⅱ转换(P=0.0258)。
　　6.LAMP-2抗体体外刺激中性粒细胞180min后较同型对照组,有大量NETs形成(P<0.0001)及靶抗原MPO、PR3、LAMP-2释放。
　　7.以Z-vad-fmk和Nec-1分别阻断凋亡和坏死,LAMP-2抗体促发的NETs形成无明显变化,3MA阻断自噬后NETs形成明显减少(P=0.0103),DPI抑制NADPH氧化酶的活性后NETs形成被阻断(P<0.0001)。
　　结论:
　　本研究发现LAMP-2抗体阳性AAV患者外周血及肾组织中存在大量NETs形成;体外证实LAMP-2抗体阻碍了中性粒细胞凋亡,促发了自噬及NETs形成,从而导致DNA及ANCA靶抗原的释放,且这一特殊死亡过程依赖于自噬及活性氧簇的产生。提示LAMP-抗体可能通过NETs形成暴露内源性危险信号,启动自身免疫反应,维持血管炎的恶性持续状态,通过对ROS的清除等手段调节中性粒细胞的异常死亡,可能为治疗AAV提供新的策略。

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缩略语表

英文摘要

第一章 前言

第二章 AAV患者NETs的检测及意义

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料及试剂

2.2.2 实验方法

2.3 结果

2.3.1 患者一般情况及临床特征

2.3.2 中性粒细胞分离及纯度鉴定结果

2.3.3 AAV患者外周血NETs及其组分的检测

2.3.4 AAV患者肾组织内存在NETs及其组分

2.5 小结

第三章 LAMP-2抗体促中性粒细胞异常死亡的机制

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料及试剂

3.2.2 实验方法

3.3 结果

3.3.1 LAMP-2抗体明显阻碍了中性粒细胞正常的凋亡进程

3.3.2 LAMP-2抗体激活中性粒细胞自噬发生

3.3.3 LAMP-2抗体促发NETs形成

3.3.4 LAMP-2抗体促发NETs形成部分依赖于自噬

3.3.5 LAMP-2抗体促发NETs形成依赖于活性氧产生

3.4 讨论

3.5 小结

全文总结

参考文献

文献综述ANCA相关性血管炎的免疫发病机制新进展

参考文献

攻读硕士期间的研究成果

致谢