鬼臼苦素抗CML干细胞的作用及其机制研究

摘要

慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）是一种起源于白血病干细胞（Leukemia Stem Cell，LSC）并严重威胁人类健康的恶性增殖性疾病。Ph染色体是CML的重要标志，它源于第9号染色体和22号染色体相互易位，使第9号染色体上大部分的c-abl原癌基因易位到22号染色体的BCR基因上而形成一个融合的BCR/ABL融合基因。该基因编码的蛋白质P210bcr/abl具有异常活跃的酪氨酸激酶活性，是导致CML发生的主要机制。格列卫（IM）是以bcr/abl融合蛋白为靶点的酪氨酸激酶抑制剂，能是大部分的CML患者得到有效的缓解。然而，由于LSC不依赖BCR-ABL的蛋白激酶活性存活，导致格列卫不能彻底清除LSC而无法治愈CML，患者必须长期服药以控制病情。格列卫价格昂贵，终生用药给患者造成沉重的经济负担。而且，长期用药将导致更多的副作用和耐药的发生。因此，迫切需要探寻有效靶向清除CML LSC的方法，以期根治CML。
　　鬼臼毒素是我国传统中药鬼臼的活性成分，但由于其是通过抑制微管蛋白发挥作用，故毒性大，限制了临床的直接应用。鬼臼苦素(picropodophyllin，PPP)是鬼臼毒素的异构体，具有順式内酯环，对微管蛋白没有抑制作用，故不具有细胞毒性。许多研究结果显示，鬼臼苦素也具有广泛的抗肿瘤效应，但是对正常细胞基本上没有毒性。这表明鬼臼苦素对肿瘤细胞有一定的特异性。目前，有报道发现鬼臼苦素能有效诱导CML原代细胞和细胞系发生细胞凋亡，以及抑制细胞系的克隆形成，但是鬼臼苦素对CML LSC的研究尚无报道，值得深入研究。为此，本研究分为三部分进行阐述：
　　1，鬼臼苦素体外抗CML LSC的作用；
　　2，以CML转基因小鼠为模型研究鬼臼苦素在体内抗LSC的作用；
　　3，鬼臼苦素靶向抗CML LSC的分子机制。
　　研究目的：
　　本论文通过研究鬼臼苦素体内外抗CML LSC的作用，阐明其分子调控机制，将为PPP研发成为新型的靶向LSC治疗CML的临床药物提供重要的理论和实验基础。
　　研究方法：
　　1.探讨鬼臼苦素体外抗人CML LSC的作用
　　1.1.利用淋巴细胞分离液分离获得CML患者和健康人（health donor，HD）的骨髓单个核细胞；利用免疫磁珠分选系统对CML和HD的骨髓单个核细胞进行分选，获得CML和健康人的CD34+细胞；流式细胞术鉴定分选出的CD34+细胞纯度。
　　1.2.流式细胞术检测PPP诱导的CML和健康人干细胞凋亡情况；克隆形成实验检测PPP处理后CML和健康人CD34+细胞克隆形成数量。
　　2.探讨鬼臼苦素抗SCL-tTA/BCR-ABL转基因小鼠LSC的作用
　　2.1.将BCR-ABL转基因小鼠和SCL-tTA转基因小鼠进行杂交得到SCL-tTA/BCR-ABL小鼠（CML小鼠），诱导发病后用流式细胞术和组织HE染色的方法对其表型和组织形态进行鉴定。
　　2.2.检测PPP治疗对CML和野生型小鼠体重以及骨髓LSC比例和数目的影响。
　　3.探讨鬼臼苦素抗CML LSC的作用机制
　　3.1.Western blotting检测CML CD34+细胞经过PPP处理后细胞内P53蛋白磷酸化及乙酰化水平；Realtime PCR（qPCR）检测CML CD34+细胞经过PPP处理后P53及其下游调控基因P21、Puma、Noxa、Bax表达水平；qPCR检测CML CD34+细胞经过PPP处理后c-Myc和BCL2表达水平；qPCR检测PPP治疗后小鼠骨髓细胞P21、Noxa和Bax基因表达水平。
　　3.2.qPCR检测CML和健康人骨髓单核细胞、CD34+CD38-细胞、CD34+CD38+细胞IGF1R基因的表达水平；ELISA方法检测CML和健康人骨髓上清中IGF1、IGF2的表达；流式细胞术检测CML和健康人骨髓单核细胞IGF1R蛋白的表达；流式细胞术检测转染IGF1RsiRNA后对K562细胞凋亡的影响；Western blotting检测PPP和IGF1R特异性抑制剂（OSI-906和AG-1024）对K562、Ku812细胞内IGF1R活性及其下游调控蛋白活性的影响；流式细胞术检测OSI-906和AG-1024对CMLCD34+细胞凋亡的影响。
　　实验结果：
　　1.探讨鬼臼苦素体外抗人CML LSC的作用
　　1.1.流式细胞术结果显示，免疫磁珠分选出的CD34+细胞纯度为89.23％，符合实验需求。
　　1.2流式细胞术检测结果显示，PPP能够诱导CML CD34+CD38-（LSC）和CD34+CD38+祖细胞发生显著的细胞凋亡，而对健康人的造血干细胞的凋亡影响较小；克隆形成实验显示，PPP能够明显抑制CML CD34+克隆形成，而对健康人CD34+细胞克隆形成的影响较小。
　　2.探讨鬼臼苦素抗SCL-tTA/BCR-ABL转基因小鼠LSC的作用
　　2.1.撤去多西环素4周诱导BCR-ABL表达后，流式细胞术结果显示SCL-tTA/BCR-ABL小鼠的外周血和脾脏中性粒细胞比例明显增高，骨髓 LSC比例明显增高；组织HE染色结果显示，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠脾脏出现明显的白细胞浸润，骨髓增生明显。
　　2.2.经PPP治疗以后，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠和野生型小鼠体重没有明显的变化；SCL-tTA/BCR-ABL小鼠骨髓LSC比例和数量明显下降，野生型小鼠骨髓LSC比例无明显变化。
　　3.探讨鬼臼苦素抗CML LSC的作用机制
　　3.1.在蛋白水平上，PPP处理后CML CD34+细胞的P53蛋白磷酸化和乙酰化水平并未明显增加；在mRNA水平上，PPP处理后CML CD34+细胞P53基因表达没有发生变化，但是其调控的促凋亡基因P21、Puma、Noxa、Bax表达明显增加，抗凋亡基因c-Myc表达水平明显下降；接受PPP治疗后，SCL-tTA/BCR-ABL小鼠骨髓细胞P21和 Noxa表达水平明显上调，与体外实验结果一致；野生型小鼠骨髓细胞P21明显上调，但是Noxa表达无明显变化。
　　3.2.流式细胞术和qPCR结果显示CML和健康人体内IGF1R表达水平无明显差异；ELISA结果显示CML和健康人骨髓上清中IGF1R的配体IGF1、IGF2的表达没有明显差异；使用IGF1R siRNA干扰K562细胞IGF1R的表达并不能诱导K562细胞发生明显的凋亡；与IGF1R特异性抑制剂相比，PPP并不能有效的抑制IGF1R的活性或者其下游信号通路；与PPP相比，IGF1R特异性抑制剂诱导CML LSC细胞凋亡的能力明显弱于PPP。
　　结论：
　　PPP具有在体内外有效靶向抗CML LSC的药理活性，其机制可能与激活P53信号通路和抑制抗凋亡基因表达相关。

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中文摘要

英文摘要

第一章 序言

1.1 研究背景

1.2 研究意义

第二章鬼臼苦素体外抗人CML LSC的作用研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 鬼臼苦素抗SCL-tTA/BCR-ABL转基因小鼠LSC的作用研究

3.1前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章鬼臼苦素抗CML LSC的作用机制研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4实验结果

4.3讨论

全文总结

参考文献

附录1 部分CML病人资料

附录2英文缩写语

附录3攻读学位期间科研情况及所受奖励

致谢