DISC1在脑白质发育中的表达及其在胶质细胞中作用的初步研究

摘要

精神分裂症断裂基因1(Disrupted-In-Schizophrenia 1,DISC1)被认为是精神分裂症发病的主要易感因素之一,其发现是在一个大样本的苏格兰家系中精神分裂症患者出现1号和11号染色体发生平衡异位(1;11)(q42.1;q14.3)。正常人类DISC1基因位于1号染色体q14.3,含有13个外显子,共编码854个氨基酸,其蛋白约93.6KD。DISC1氨基酸序列包含多个功能结构域,能够与200多个蛋白分子相互作用,直接或间接的参与多个信号通路。研究该基因在中枢神经系统中的功能作用对精神分裂症的发病机制及临床诊治具有重要意义。目前关于脑内DISC1功能的认识多集中在其对神经元(Neuron)作用的研究,如DISC1可调节神经元迁移、轴突生长、突触传递和控制发育大脑中神经元过度整合等等。而作为脑内更多数量的保护、营养和支持神经元的胶质细胞(GlialCell),如星形胶质细胞(Astrocyte,AST)和参与髓鞘形成少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)等,DISC1对它们的作用认识还鲜有报道。
　　近年来临床研究发现精神分裂症病人经常伴随有脑白质发育异常,包括胼胝体发育不全和侧脑室扩大等病理结构改变,而结合本实验室前期系列研究也说明脑白质异常参与了精神分裂症的发病。为此我们推测DISC1可能参与了大脑白质发育过程的调节,其作用可能通过调控少突胶质细胞(OL)或星形胶质细胞(AST)的发育或功能来实现。
　　因此本研究我们首先利用体外分离培养的星形胶质细胞(AST)和少突胶质前体细胞(Oligodendroglia precursor cell,OPC)及分化成熟的少突胶质细胞(OL)以及出生后脑白质发育模型,检测DISC1的表达;进而利用从胼胝体区克隆出来的全长DISC1基因序列,构建DISC1-GFP融合蛋白表达质粒并转染少突胶质细胞系以及星形胶质细胞,观察其对少突胶质细胞系(Oli-neu)和星形胶质细胞的影响。最后利用DISC1基因突变小鼠(L100P),分离培养AST;观察DISC1基因突变后对AST细胞形态及钙信号途径的影响。
　　本研究总共分为三部分;
　　第一部分:DISC1基因在胶质细胞和脑白质不同发育阶段的表达
　　体外分离培养AST、OPC和OL细胞,利用Q-PCR、WB及ICC检测各胶质细胞中DISC1表达。
　　进一步通过Q-PCR及Western Blot检测P0、P7、P15、P21和成年的SD大鼠脑内胼胝体和视神经的DISC1表达情况。
　　主要结果如下:
　　1、体外分离培养的AST、OPC和OL细胞都有DISC1表达,与阳性对照的脑组织以及分离培养的NSC条带大小一致;并且在离体情况下DISC1在OPC和OL中的表达明显强于AST。
　　2、在不同发育阶段,脑白质胼胝体和视神经内DISC1基因总体表达量首先呈现下调趋势,随后表达上调(P<0.05);Q-PCR结果与Western Blot结果趋势基本一致(P<0.05)。
　　3、DISC1蛋白为双带,不同发育阶段的胼胝体和视神经,分子量大的重链随着发育成熟,DISC1表达逐渐下调(P<0.05),而分子量小的轻链,表达则呈现出上调趋势(P<0.05)。
　　以上结果说明,随着大脑白质的发育成熟,DISC1表达存在明显差异。DISC1可能对大脑白质的发育分化起到重要作用,并且这种作用可能是通过对少突胶质细胞和星形胶质细胞的作用来实现的。
　　第二部分:脑白质DISC1基因真核表达质粒的构建及其在胶质细胞中的表达
　　利用分子克隆等相关实验技术,构建脑白质胼胝体DISC1表达质粒,通过基因测序及转染AST和Oli-neu少突胶质细胞系鉴定质粒表达蛋白,并观察检测对Oli-neu和AST细胞的影响。
　　主要结果如下:
　　1、成功从小鼠胼胝体区提取RNA,通过高保真酶从小鼠胼胝体cDNA成功扩增出DISC1开放阅读框约2500bp序列。
　　2、DISC1开放阅读框序列成功连接到pEGFP-n1表达载体,测序结果显示连接在载体上的目的片段2556bp,无突变位点并能够正确编码翻译DISC1蛋白。
　　3、转染Oli-neu少突胶质细胞系,Western Blot检测发现对少突胶质细胞相关蛋白PDGFRα和MBP表达影响并不明显。转染AST后发现其胞体变大,质膜伸展面积明显比对照组增多。在等量GFP的情况下,AST细胞内表达的GFAP和β-acting比对照明显上调(P<0.05)。
　　本部分结果说明DISC1高表达后对AST的形态和功能有明显影响。
　　第三部分:DISC1突变对AST形态和钙信号途径的影响的初步观察
　　采用DISC1基因突变小鼠(L100P),分离培养AST;观察DISC1基因突变后对AST细胞形态及钙信号途径的影响。
　　主要结果如下:
　　1、DISC1基因(L100P)突变后,AST细胞形态与对照组相比明显异常,细胞变大、边缘变圆;细胞突起回缩、不明显(P<0.05)。
　　2、DISC1(L100P)突变AST,在5mMK+刺激下敏感性显著增加,钙释放显著增强,出现次级钙震荡波(p<0.05);突变组钙释放强度显著高于对照组。
　　3、Q-PCR结果显示DISC1突变的AST内DISC1表达明显上调,同时钙通道蛋白RyR3蛋白的表达量增加(P<0.05)。
　　以上结果说明DISC1是维持AST的功能作用的主要因素之一;同时提示DISC1基因异常所引起的AST功能受损可能是精神分裂症发病的又一原因。

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缩略语表

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第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景及意义

1.3 研究内容

1.4 研究材料和配方

1.5 研究方法

第二章 DISC1基因在胶质细胞和脑白质发育过程中的表达

2.1主要材料与方法

2.2实验内容

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三章 脑白质DISC1基因真核表达质粒的构建及其在胶质细胞中的表达

3.1主要材料与方法

3.2实验内容

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四章 DISC1突变对AST形态和钙信号途径影响的初步观察

4.1主要材料与方法

4.2实验内容

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

全文总结

参考文献

文献综述DISC1调节脑发育的作用及相关分子机制

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢