抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备及其免疫传感器的初步研究

摘要

细菌感染导致的抗生素滥用致细菌耐药是我国乃至全球范围最突出的公共卫生问题之一,并且由其导致的脓毒血症也严重危害着人类健康,成为非心脏ICU死亡的主要原因。普通的细菌感染本身并不可怕,只要早期诊断明确并针对性治疗,不会造成严重后果。所以,细菌感染的早期诊断和鉴别诊断极为重要。临床常用传统感染诊断指标主要有外周白细胞计数(WBC)、血液中C反应蛋白(CRP)和血液细菌培养等,但都存在费时、误差大、灵敏度低、特异性差等缺点,因此,应用新的标志物来诊断细菌感染性疾病非常必要。降钙素原(PCT)是一种有116个氨基酸残基组成、分子量为13kDa的糖蛋白,血清降钙素的前体物。生理情况下,血中PCT浓度极低,基本检测不到,但在一些细菌感染性疾病,包括细菌感染引发的全身炎症反应、败血症或脓毒性休克等患者中血清PCT水平显著升高,并且和疾病严重程度呈正相关。因此,PCT可作为一种高灵敏的新的炎症检测指标。在临床中,血液中PCT的浓度变化应用于多种感染性疾病的诊断与鉴别诊断,可对感染性疾病进行感染程度的判断和治疗效果的评定,同时,可指导抗生素用药。PCT的便利、快速和准确测定为细菌性感染的诊断及治疗提供了新的可靠依据。目前PCT的主要测定方法包括定性(半定量)测定和定量测定两种方式。主流的诊断产品均为国外进口,价格昂贵。因此,研发具有自主知识产权、有较高灵敏度和特异性的PCT检测技术和相应产品,具有重要的社会和经济价值。
　　主要研究内容和结果:
　　1.重组PCT蛋白的原核表达与纯化
　　从GENBANK获得PCT编码基因及其他相关分子结构等基本信息,通过Graphicalcodonusageanalyzer(http://guca.schoedl.del)分析密码子偏性并将基因序列5’端和3’端分别加入酶切位点及保护碱基后进行全基因合成。通过构建PCT原核表达载体,将PCT的DNA序列克隆入pET28a,再将重组质粒pET28a-PCT转化入大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/LIPTG诱导表达表达6h,得到融合蛋白,分子量约15kDa。15％SDS-PAGE鉴定表达蛋白破菌后在上清里,为可溶性表达。进行镍金属螯合层析纯化后鉴定,15%SDS-PAGE图谱显示几乎呈单一条带,分析结果显示其纯度可达90%以上。用Lowry氏法测得蛋白浓度为5mg/ml。纯化的重组蛋白PCT经特异性鉴定,即为目标蛋白,可用于免疫检测标准品及单克隆抗体制备的筛选。
　　2.抗人PCT单克隆抗体的制备鉴定及初步应用
　　依据在线软件预测,综合分析Chou&Fasman法预测蛋白结构β转角、Karplus&Schulz法预测蛋白柔韧性、Emini法预测抗原表面的可及性、Kolaskar&Tongaonkar法分析蛋白质抗原性、Bepipred法预测线性抗原表位、Parker法分析蛋白质疏水性等获得三段表位肽。人工合成3个肽段与BSA交联作为免疫原免疫Balb/c小鼠,细胞融合后通过复查及亚型分析保留7株抗体。采集小鼠单抗腹水经ProteinAHP.F.F亲和纯化柱纯化,纯化后的抗体用间接ELISA法检测效价,均在1:64000以上,选出三株结合能力高、效果好的PCT单克隆抗体2-D7、2-H12、4-H12并对其抗体其他特性进行鉴定。最终选出特异性、效价和亲和力最好的单克隆抗体2-D7用Westernblot和免疫组化进一步鉴定其特异性。由Westernblot结果得出单克隆抗体2-D7能结合重组PCT抗原,与无关蛋白H-FABP不反应,表明其有好的特异性;免疫组化结果显示,2-D7能特异识别正常甲状腺及甲状腺癌组织中PCT蛋白,并初步鉴定PCT抗原在甲状腺癌组织有较高表达。
　　之后,用单克隆抗体2-D7作为包被抗体,酶标PCT抗体作为检测抗体,成功建立了重组蛋白PCT检测的ELISA体系。此免疫检测体系经过优化后,对60例细菌培养阳性血清和40例健康体检血清进行了检测,正常组PCT浓度为4.41±2.76ng/ml,感染组PCT浓度为35.70±15.03ng/ml,结果显示二者之间具有显著性差异(*P<0.05),说明建立的配对抗体检测体系能够区分正常血清与感染血清之间的差异。再用本研究抗体检测体系与安图公司配对抗体对临床血清进行检测,本研究抗体检测阳性率为83.3%,而安图公司抗体阳性率为86.67%,所得结果表明我们的抗体检测水平已基本达到安图公司抗体检测水平。所得单克隆抗体为下一步PCT检测的研究提供了坚实的基础。
　　3.抗人PCT免疫传感器检测的初步研究
　　电化学发光免疫传感器由于其简便、快速、灵敏度高、选择性好等特点具有良好应用前景,尤其在临床检测方面得到越来越多的关注。我们首先将玻碳电极在L-Cys中电聚合在表面成膜,同时制备二抗生物偶合物GRA-Pd-PtNPs@anti-PCT-GOD,通过层层自组装修饰于电极表面,加入鲁米诺-H2O2共反应试剂,ECL信号显著增高,达到理论预期效果,成功制备了PCT夹心式电化学发光免疫传感器。对PCT免疫传感器各项性能进行了检测,结果表明免疫传感器各项性能良好。同时,模拟人体正常环境加入人血清进行PCT检测,结果证明该免疫传感器可以用于临床实际样品的检测。结果表明电化学发光免疫传感器对PCT的检测是可行的,为后续的新纳米材料的使用、新检测方法等的研究提供了新思路,也为进一步大样本检测研究、实现临床应用等奠定了基础。

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缩略语表

英文摘要

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第一章 前 言

1.1 选题依据

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 重组PCT蛋白的原核表达与纯化

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章 抗人PCT单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

3.1材料与方法

3.2结 果

3.3讨论

第四章 抗人PCT免疫传感器检测的初步研究

4.1材料与方法

4.2结 果

4.3讨论

全文总结

参考文献

文献综述PCT检测的临床意义与方法进展

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢