Liver X receptorβ对小鼠视网膜发育和视觉功能的影响及机制研究

摘要

肝脏X受体（Liver X receptors，LXRs）是在哺乳动物体内广泛分布的核受体家族成员，主要分为两种亚型:LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)，前者主要分布于肝脏、小肠、胰腺等脂类代谢相关器官，后者则主要分布于中枢神经系统和免疫系统。LXRs在调节胆固醇代谢和炎症反应中发挥重要作用，参与中枢神经系统板层结构发育以及阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和帕金森病（Parkinson's disease，PD）等神经退行性疾病的病理生理过程。作为中枢神经系统的延续，视网膜同样也高表达LXRβ，但该受体在视网膜发育和视功能中所起的作用尚不清楚。
　　既往研究发现，LXRβ敲除可以通过影响放射状胶质细胞(Radial glial cells，RGCs)的长纤维形成而阻碍大脑皮层新生神经元的“内向外”(inside out)的放射状迁移，导致大脑皮质板层发育障碍。Müller细胞被认为是位于视网膜中的特殊放射状胶质细胞，在视网膜的发育中起着十分重要的功能。研究表明，在视网膜发育过程中特异性损伤Müller细胞可导致视网膜感光细胞异位分布。离体实验也证实，与Müller细胞共培养的视网膜细胞球可以恢复正常的板层结构，并形成排列规则的感光细胞层，而无Müller细胞共培养的感光细胞球则形成大量的“玫瑰花结”样结构，提示Müller细胞在视网膜板层结构建立中同样也起着十分重要的作用，可能发挥类似于中枢神经系统板层构筑中的RGCs作为支架引导新生神经元的迁移的作用。
　　成年视网膜中Müller细胞对维持内层视网膜稳态十分重要，主要参与了神经视网膜中神经递质包括兴奋性神经递质谷氨酸、抑制性神经递质γ-氨基丁酸等的清除和代谢。Müller细胞还参与了内层视网膜的水盐代谢、视网膜血流和视网膜糖代谢的调节。其中，在调节视网膜中谷氨酸稳态时，特异性表达于Müller细胞内的谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase， GS）在“谷氨酸-谷氨酰胺”循环中发挥着重要作用。GS表达量及活性将直接影响到Müller细胞清除内核层（inner nuclear layer，INL）中谷氨酸的速率，GS表达量的下调将引起细胞外谷氨酸含量增加，导致兴奋性神经毒性作用。既往研究发现，GS的下调与视网膜电图（electroretinogram，ERG）的功能变化呈正相关。在视网膜变性时，Müller细胞往往过度活化，表现为细胞形态、数量以及表达标志物的改变，此时Müller细胞对视网膜的调节作用受到影响。在一定条件下，M讧ller细胞又可作为潜在的内源性视网膜干细胞，可分化产生视网膜中的神经元和胶质细胞。这一特点与位于大脑以及小脑中的RGCs一致。LXRβ对成年小鼠视网膜中的Müller细胞和视觉功能有何影响，目前尚无文献报道。
　　LXRs具有调节中枢神经系统炎症反应的作用，该调节作用与其抑制小胶质细胞以及星形胶质细胞的激活密切相关。研究发现，在LXRβ-/-小鼠的黑质部位多巴胺神经元丢失明显多于野生小鼠，而活化的小胶质细胞和星形胶质细胞在LXRβ-/-小鼠黑质中明显增加。在AD模型中，LXRs激动剂可以抑制星形胶质细胞细胞的活化，减缓AD的进展。因此，LXRs可以通过抑制神经退行性疾病中的胶质活化，减少神经元丢失。视网膜变性时也存在胶质细胞的增生，增殖性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)以及增殖性的糖尿病性视网膜病变(proliferative diabeticretinopathy，PDR)时，Müller细胞即发生增殖及纤维化，于玻璃体下腔中形成“胶质封闭”，影响视网膜修复。LXRs的激活是否可以减轻病理状态下视网膜中炎症反应和胶质增生目前还不清楚。在酒精致视网膜损伤的动物模型中常常可观察到增强的胶质细胞活化，以及神经节细胞、双极细胞、水平细胞等细胞数量和细胞形态的改变。因此，我们采用此种动物模型来研究LXRs对损伤状态下视网膜的影响及可能机制。
　　因此，本研究提出如下假设:在发育阶段和成年阶段，LXRβ通过影响视网膜中Müller细胞功能而影响小鼠视网膜结构及功能。激活LXRs可减轻酒精损伤新生小鼠视网膜的胶质细胞激活和神经元丢失。
　　本文的主要研究结果如下:
　　1.LXRβ对新生小鼠视网膜板层构筑的影响
　　采用HE染色、BrdU标记，免疫组化等技术，观察LXRβ-/-小鼠和同龄的野生型小鼠视网膜结构改变。结果显示:出生后7天，LXRβ-/-小鼠的视网膜内核层(INL)较同龄野生小鼠INL显著增厚(p＜0.01)。BrdU阳性细胞分析结果显示，LXRβ敲除后并不影响视网膜神经元的增殖能力。LXRβ-/-小鼠视网膜INL中BLBP阳性细胞较同龄的野生小鼠显著增多，而ONL中BLBP阳性细胞减少。
　　2.成年LXRβ-/-小鼠和同龄野生小鼠视网膜结构及视功能研究
　　通过检测3月龄、7月龄、10月龄雄性LXRβ-/-和同龄野生小鼠的暗适应ERG，发现LXRβ-/-小鼠ERG-a波和ERG-b波幅值均较同龄野生小鼠幅值显著降低(p＜0.01)，而a、b波的潜伏期无明显差异(p＞0.05)。免疫组化及Western-blot检测发现:LXRβ-/-小鼠Müller细胞终足部位GS的表达较野生小鼠明显减弱(p＜0.05)，全视网膜GS表达也较野生小鼠显著减少(p＜0.01)。LXRβ-/-小鼠PKC-α阳性双极细胞和PKC-α蛋白水平明显降低(p＜0.05)。而感光细胞标记Rhodopsin免疫组化及WB结果均未发现LXRβ-/-和同龄野生小鼠之间有明显差异(p＞0.05)。
　　3.LXRs激动剂对酒精视网膜损伤小鼠模型的保护作用研究
　　为进一步证实LXRs在视网膜中的作用，采用酒精暴露致视网膜损伤的新生小鼠模型，通过HE染色和免疫组织化学法进行检测发现:出生后6天(P6)时酒精可导致视网膜节细胞层中细胞数量减少(p＜0.01)。酒精暴露新生小鼠视网膜GCL中NeuN阳性细胞数较对照组明显减少(p＜0.01)，酒精暴露组与T0预处理组相比，NeuN阳性细胞也明显减少(p＜0.05)。酒精暴露组GFAP表达较对照组明显增加(p＜0.01)，酒精暴露组与T0预处理组相比，GFAP表达也明显减少(p＜0.05)。出生后10天(P10)时，视网膜切片HE染色、NeuN和GFAP结果趋势与P6时相同，即酒精处组GCL中细胞密度以及NeuN阳性细胞较对照组和T0预处理组明显减少。P10发现酒精暴露小鼠GS表达量和PKC-α阳性细胞数均较对照组下降，而提前给予激动剂可以减轻酒精的这一作用。
　　结论:
　　1.LXRβ敲除导致新生小鼠(P7)视网膜中Müller成熟延迟，导致视网膜新生神经元迁移异常，导致视网膜INL较同龄的野生型小鼠一过性增厚。
　　2.LXRβ通过影响Müller细胞中GS表达和INL中PKCα阳性细胞数量，导致视网膜ERG改变。
　　3.新生期酒精暴露可激活视网膜中的胶质细胞并导致GCL中NeuN阳性神经元丢失，而提前给予小鼠LXRs激动剂T0901317处理可以翻转这一效应。

目录

声明

缩略语表

摘要

总材料与方法

第一部分 LXRβ对新生小鼠视网膜板层构筑的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 LXRβ-／-对成年小鼠视网膜结构及视功能的影响及机制研究

前言

第一节 LXRβ-／-小鼠视网膜ERG功能研究

材料与方法

结果

第二节 LXRβ-／-成年小鼠视网膜结构改变

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 LXRs激动剂对酒精致视网膜损伤小鼠模型的调节作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

参考文献

文献综述 LXRβ在中枢神经系统发育和退行性改变中的调节作用及机制研究进展

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