Rab5介导的β-AR囊泡运输调控肺微血管内皮细胞损伤的机制

摘要

急性呼吸窘迫综合症早期特征是肺微血管内皮细胞(PMECs)损伤后通透性增高,肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液,肺微血管内皮完整性是治疗和预防发生ARDS的重要环节。Beta-肾上腺素受体(Beta-adrenergic receptorβ-AR)在调控内皮细胞过程中发挥重要作用。β-ARs具有三种亚型,β1-AR和β2-AR主要在心脏、肺脏等重要脏器血管系统发挥一定的作用,而β3-AR主要与脂肪组织相关。受体信号通路的激活与受体的内吞、脱敏、循环和降解等密切相关,任何影响这些过程的因子都可能对内皮细胞的功能发挥调节作用。我们既往研究表明Rab1可调节β-AR在细胞膜上的表达,从而调控LPS损伤肺微血管内皮细胞过程的机制,为临床药物干预提供了新的靶点和策略。
　　Rab5作为Ras超家族的一个成员,主要有Rab5a、Rab5b和Rab5c三种亚型,研究最多的是Rab5a。在HEK293、cos-1等细胞,Rab5主要调控细胞囊泡从细胞膜向早期内涵体的锚定和融合,同时其介导的内吞过程可能参与激动剂诱导的受体下调。但是,在肺微血管内皮细胞,Rab5介导β-ARs的内吞和下调的机制以及对屏障功能和通透性的调控作用尚未研究。
　　本实验利用LPS处理大鼠肺微血管内皮细胞,模拟急性呼吸窘迫综合症的细胞病理,转染野生型和负性突变体的Rab5a以及小干扰RNA,研究了Rab5a调控肺微血管内皮细胞β-AR胞内运输、膜上的表达、内吞和下调等过程的机制,同时,研究了β-AR信号通路的激活与内皮细胞紧密连接和粘附连接的调控关系,以及Rab5a如何参与调控β-AR信号通路调节肺微血管内皮细胞屏障功能及渗透性。
　　研究方法:
　　1.采用原代培养技术培养大鼠PMECs,并对其进行综合鉴定:CD34、BSI、Ⅷ因子,同时观察各代细胞的结构和亚结构。
　　2.实时细胞监测仪iCELLigence系统对细胞屏障功能进行实时监测。
　　3.运用Western Blot检测LPS处理RPMECs后occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜和浆内表达情况。
　　4.应用荧光显微镜观测转染Rab5a WT、Rab5a S34N、Rab5a siRNA后β2肾上腺素受体在细胞内的亚定位。
　　5.应用内吞实验和下调实验检测转染Rab5a WT、Rab5a siRNA后β2肾上腺素受体的内吞和下调变化。
　　6.运用ELISA法检测RPMECs经LPS处理以及转染Rab5a siRNA后监测细胞指数改变。
　　研究结果:
　　1.综合鉴定结果显示:CD34,Ⅷ因子和BSI结合试验阳性,电镜下可见细胞膜,细胞核,内质网,线粒体及溶酶体等亚结构。
　　2. LPS处理RPMECs后细胞指数呈时间和浓度依赖形式降低,屏障功能在6-8h之间破坏最明显。同时,occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜上的表达显著降低。β2肾上腺素受体激活能减弱细胞指数的降低程度,同时也能抑制两种连接蛋白的减低。
　　3.正常情况下,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激动剂ISO后,主要聚集在胞浆;转染Rab5a WT后,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激动剂ISO后,主要聚集在胞浆;转染Rab5a siRNA后,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激动剂ISO后,仍然聚集在胞膜。
　　4.转染Rab5a S34N和Rab5a siRNA后,膜表面β-AR分别增加23.9％和28.3%,β2-AR分别增加32.1%和35.6%,转染Rab5a WT无明显改变。LPS处理RPMECs后β2-AR降低42%,可被Rab5a S34N和Rab5a siRNA分别提高39%和37%。
　　5.[3H]-CGP12177诱导的受体内吞在30min时达到最高,Rab5a siRNA显著抑制内吞速率;Rab5a WT无明显作用。ISO诱导的受体下调在16h达到最低,Rab5a siRNA显著抑制受体下调;Rab5a无明显作用。
　　6.Rab5a基因下调后对内皮屏障功能无明显改变,但转染后加入激动剂ISO或ISO/Atenolol后,LPS对内皮屏障功能的破坏作用较正常组明显减弱。同时,内皮细胞对BSA的通透性也有相似的改变。
　　结论:
　　1.β2-AR信号通路对LPS导致的RPMECs屏障功能的破坏有一定的保护作用。
　　2.Rab5a可调节β2-AR的胞内转运和膜上的表达。
　　3.Rab5a通过调节β2-AR调控RPMECs的屏障功能和对大分子的渗透性。

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第一章 前言

第二章 β2-AR信号通路参与调节大鼠肺微血管内皮细胞(PMECs)的屏障功能

2.1 大鼠肺微血管内皮细胞的培养和鉴定

2.2 β2-AR信号通路调控大鼠肺微血管内皮细胞(RPMECs)的屏障功能

第三章 Rab5a对 β-AR在大鼠肺微血管内皮细胞膜表达

3.1 Rab5a对 β-AR 在大鼠肺微血管内皮细胞胞内转运及膜表达的

3.2 Rab5a对 β-AR 在大鼠肺微血管内皮细胞内吞和下调的影响

第四章 Rab5a对大鼠肺微血管内皮细胞屏障功能

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

参考文献

致谢