Rab5 GTPase介导的VE-cadherin内吞调控肺微血管内皮细胞屏障功能的机制

摘要

研究背景:
　　血管内皮细胞衬于血管壁内侧形成半选择性的通透屏障，可以调节血浆蛋白、溶质、液体及炎症细胞的转运。内皮完整性是维持内皮屏障功能的基础。内皮屏障的破坏及内皮通透性的增加是许多急慢性炎症性疾病发病机制中必不可少的组成部分，其中包括急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)、动脉粥样硬化、肿瘤等。细胞间连接包括粘附连接、紧密连接、桥粒和缝隙连接。其中内皮细胞主要表达粘附连接和紧密连接，它们在维持内皮细胞完整性及内皮细胞正常生物学功能中发挥重要作用。细胞间粘附连接参与调控多种细胞功能，包括建立和维持细胞间粘附、细胞骨架重构、细胞内信号传导及转录后调控等。紧密连接主要参与调控内皮通透性。研究表明粘附连接的组装和构建先于紧密连接，并且作为内皮特异性的粘附连接—血管内皮钙黏连蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）在维持血管完整性上起重要作用，包括骨架重排、细胞极性的建立及紧密连接的重构等。
　　研究表明Rab蛋白是一类小分子GTP结合蛋白，在囊泡运输的转运、粘附、锚定和融合等不同阶段均发挥着重要的调控作用。Rab蛋白通过介导囊泡运输，调节多种细胞表面受体分子的表达和功能。其中，Rab5作为早期内涵体的标记物，可介导胞膜蛋白至内涵体的囊泡运输。既往研究表明Rab5不仅可以调节G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors，GPCR)的转运，还参与调控细胞间连接蛋白的定位，并且Rab5可通过影响受体酪氨酸激酶的活性来调节边缘细胞迁移和极性。另外，Rab5及其效应因子在维持平面细胞极性(planar cell polarity, PCP)中也发挥重要作用。然而，作为粘附连接的重要组分—VE-cadherin，能否被Rab5调控及Rab5如何调控其内吞，继而调控内皮细胞极性及屏障功能目前尚不明确。
　　本研究中我们应用人肺微血管内皮细胞(human lung microvascular endothelial cells，HPMECs)通过抑制或过表达其中Rab5的表达，观察脂多糖(LPS)对内皮细胞中VE-cadherin内吞、骨架重构及细胞极性的影响，并且应用体内外实验研究Rab5对内皮屏障功能的调节作用。初步探讨了Rab5调节内皮屏障功能的机制。实验结果有望为内皮屏障功能障碍和血管炎症的防治提供新的思路和有价值的潜在靶标。
　　研究目的:
　　1.明确LPS对HPMECs中Rab5表达及活性的影响。
　　2.探讨Rab5对HPMECs中VE-cadherin内吞及细胞极性的调节作用。
　　3.体内外研究探讨Rab5调节内皮屏障功能的机制。
　　研究方法:
　　1.培养HPMECs，应用western blot(WB)检测LPS处理后不同时间点HPMECs中Rab5a蛋白及其活性形式的表达变化。
　　2.应用WB及激光共聚焦检测HPMECs中VE-cadherin、F-actin的表达和定位。
　　3.应用E-plate L8培养板培养HPMECs，通过iCELLigence系统实时监测内皮细胞屏障功能。
　　4.HPMECs转染NC siRNA、Rab5a siRNA、NC plasmid、Rab5a WT plasmid后，抑制或过表达Rab5a的表达，并应用WB及激光共聚焦技术检测VE-cadherin、F-actin的表达及定位变化;应用激光共聚焦检测细胞顶端标记物足萼蛋白(podocalyxin，Podxl)的顶端-基底侧极性表达情况。
　　5.应用Transwell小室培养HPMECs，并检测FITC-dextran的透过率以反映内皮细胞通透性。
　　6.应用Cy3-标记的Rab5a siRNA体内转染C57BL/6小鼠，6天后收集小鼠肺脏、肝脏、脾脏及肾脏组织标本置于液氮中保存，用于冰冻切片免疫荧光检测Cy3在组织器官的分布情况，RT-PCR检测各组织器官中Rab5a mRNA的表达情况，以计算Rab5asiRNA的转染抑制率。
　　7.脓毒症模型的建立。20mg/kg LPS腹腔注射入转染或未转染Rab5a siRNA的C57BL/6小鼠体内，24h后收集肺组织，冰冻切片用于免疫荧光检测肺组织中Rab5a的表达情况;石蜡切片，用于HE染色进行组织病理学检测。
　　8.肺血管通透性检测，40 mg/kg伊文思蓝在LPS处理结束前2h尾静脉注入C57BL/6小鼠体内检测肺组织中伊文思蓝的含量以反映肺血管通透性。
　　9.观察体内抑制Rab5a表达后脓毒症小鼠生存率变化。转染或未转染Rab5a siRNA的C57BL/6小鼠腹腔注射40 mg/kg LPS，后每天四次固定时间观察小鼠生命体征，共观察5d。
　　研究结果:
　　1.LPS处理HPMECs后Rab5a的表达及Rab5a GTP酶的活性均增加。LPS引起了骨架蛋白聚合，诱导细胞皮质部位大量应力纤维形成。
　　2.LPS减少了HPMECs胞膜VE-cadherin的表达，增加了其在胞浆中的表达，总量未变。LPS引起VE-cadherin转位。通过与内涵体标记物EEA1、Rab5共标显示，LPS引起了HPMECs中VE-cadherin的内吞。LPS还引起骨架蛋白F-actin的重构，并且破坏了内皮细胞极性及其屏障功能。
　　3.Rab5a调控LPS损伤引起的VE-cadherin的内吞。应用Rab5a siRNA抑制Rab5a表达后，LPS引起的VE-cadherin内吞明显受到抑制，抑制了LPS引起的胞膜VE-cadherin的减少。然而应用Rab5a WT质粒过表达Rab5a对LPS引起的VE-cadherin内吞无明显影响。
　　4.Rab5a可以调节F-actin的排列、Podxl顶端-基底侧的表达，从而影响内皮细胞顶端-基底侧细胞极性。抑制HPMECs中Rab5a的表达后明显减弱了LPS引起的骨架重构及Podxl异常的顶端-基底侧表达，有助于维持内皮细胞极性。
　　5.Rab5a调节HPMECs的屏障功能。应用细胞屏障功能及内皮通透性检测，结果显示Rab5a siRNA明显抑制了LPS引起的屏障破坏并降低内皮通透性的增加。
　　6.体内实验证实脓毒症小鼠肺组织中Rab5a的表达明显上调。
　　7.体内实验研究显示Rab5a siRNA可成功转染至小鼠体内，Rab5a siRNA明显抑制了小鼠肺组织中Rab5a的表达。抑制Rab5a表达的可明显减弱LPS引起的肺损伤程度及肺血管的通透性，并且提高了脓毒症小鼠的生存期。
　　结论:
　　1.体内外实验发现LPS可上调肺内皮中Rab5a的表达及Rab5a GTP酶的活性。
　　2.Rab5a可调节HPMECs中VE-cadherin的胞吞和F-actin的分布;并可调节HPMECs顶端-基底侧细胞极性及内皮屏障功能。
　　3.抑制Rab5a的表达可部分防治LPS引起的肺损伤。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 LPS对肺微血管内皮细胞屏障功能的破坏

2．1 LPS对肺微血管内皮细胞Rab5 GTPase表达的影响

2．1．1 材料和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

2．2 LPS对肺微血管内皮细胞屏障功能的影响

2．2．1 材料和方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．2．4 小结

第三章 Rab5 GTPase调节肺微血管内皮细胞屏障功能

3．1 Rab5 GTPase调节HPMECs粘附连接VE-cadherin的胞吞作用

3．1．1 材料和方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．1．4 小结

3．2 Rab5 GTPase调节肺微血管内皮细胞极性及内皮屏障功能

3．2．1 材料和方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．2．4 小结

第四章 Rab5 siRNA体内转染可保护脓毒症小鼠肺血管内皮屏障功能

4．1 LPS对脓毒症小鼠体内Rab5a表达的影响

4．1．1 材料和方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

4．1．4 小结

4．2 Rab5 siRNA体内转染在小鼠体内的分布情况

4．2．1 材料和方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．2．4 小结

4．3 Rab5 siRNA体内转染对脓毒症小鼠内皮屏障功能的调节

4．3．1 材料与方法

4．3．2 结果

4．3．3 讨论

4．3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述一 VE-cadherin相关研究进展

文献综述二 肌动蛋白微丝与内皮屏障功能

在读期间发表论文情况

致谢