非酒精性脂肪性肝病对男性生殖功能的影响及机制探讨

摘要

近年来,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率逐年升高,带来的健康危害也越来越严重,已成为当今全球性的社会和医学问题。国内外众多研究表明,NAFLD可以对除肝脏以外的系统,如肾脏、甲状腺和心血管系统等产生影响,学者的既往研究主要集中于NAFLD与糖尿病、心脏病及慢性肾病之间的关联及其相互作用机制,而对内分泌系统影响的研究涉及不多。最新研究表明NAFLD容易导致性激素代谢紊乱,而性激素水平与生殖功能密切相关,但NAFLD是否影响生殖功能尚不得而知。因此,本研究重点探讨NAFLD对男性生殖功能的影响及其潜在机制具有重要的临床意义。
　　本研究第一部分采用现况调查的方法,以重庆市成年男性为研究对象,通过问卷调查和B超筛选出NAFLD人群,检测其性激素水平和精子质量,评估NAFLD患者的生殖健康状况。第二部分建立NAFLD雄性 SD大鼠模型,检测血清和睾丸中睾酮含量及精子质量,并观察睾丸组织形态学改变、生殖细胞分化、凋亡情况及雄鼠生育能力。第三部分选取睾酮合成关键酶基因信号通路为研究靶点,检测StAR、P450scc、P45017α及AC-cAMP-PKA通路相关基因和蛋白的表达差异,初步探讨NAFLD影响生殖功能的可能机制。本研究将为临床采取科学、合理、有效的干预措施提供一定的理论依据。
　　研究内容:
　　第一部分非酒精性脂肪性肝病男性患者生殖健康的流行病学调查
　　1.现况调查:本研究以重庆市城区为研究现场,随机选取渝中区、江北区和涪陵区社区513名成年男性为研究对象,通过问卷调查收集人口学资料、生育情况、生活习惯和既往史等信息,并由大坪医院消化内科高资历主治医师对研究对象行男科体格检查。所有研究对象均完成腹部彩色超声检查,根据2006年NAFLD诊疗指南中的B超诊断标准,将研究人群分为对照组、NAFLD组和NASH组。
　　2.生物标本采集分析:2013年6月抽取每名研究对象静脉血10ml,检测血常规、肝肾功、生化和血脂等,其中性激素检测指标包括睾酮、雌激素(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体素(LH)、性激素结合球蛋白(SHBG)和抑制素 B(INB);同时收集精液和尿液,进行精子质量分析和尿常规检查,其中精子质量检测指标包括液化时间、体积、PH值、精子密度、精子活性和精子形态学,上述检测均由大坪医院检验科统一完成。
　　第二部分非酒精性脂肪性肝病对雄性SD大鼠生殖功能的影响
　　1.动物模型:5周龄SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为3组(每组20只),即对照组(正常饮食12周)、NAFLD组(高脂饮食12周)和N-3治疗组(高脂饮食12周,第9周开始N-3治疗)。12周后,各组随机选取大鼠10只处死,行各项指标的取材和检测,每组剩余的10只雄鼠与雌性大鼠合笼1周(1:2),记录雌鼠妊娠情况,于妊娠第20 d处死一半雌鼠,记录吸收胎、死胎和活胎数,剩余雌鼠自然分娩,观察 F1代仔鼠1周的生长发育情况。
　　2.生殖指标的检测:检测大鼠血清性激素和睾丸中睾酮水平,采集一侧附睾尾精子分析精子密度、精子活性和精子形态学的改变,并观察睾丸组织形态学、生殖细胞分化和间质细胞数量等指标,最后通过交配实验观察大鼠的F1代仔鼠生长发育情况。
　　第三部分非酒精性脂肪性肝病对雄性生殖损伤的机制探讨
　　分别提取大鼠睾丸组织中的RNA和总蛋白。运用半定量RT-PCR法和Western blot法检测睾酮合成通路中StAR、P450scc和P45017α等基因和蛋白的表达差异,并采用ELISA方法检测AC活性和cAMP含量。
　　研究结果:
　　第一部分非酒精性脂肪性肝病男性患者生殖健康的流行学调查
　　1.人群特征:共招募513名志愿者,最终285名研究对象(55.6％)完成了整个研究的调查步骤,其中对照组103人,NAFLD组97人,NASH组85人。三组人群年龄、学历、职业、婚姻状况、收入水平、BMI、吸烟和饮酒等基本特征无统计学差异。NAFLD组和NASH组中WBC、RBC、HGB、HCT、TBIL、AST、ALT、GGT、CHOL、TG、CREA和URIC均显著高于对照组,其他指标无统计学差异。
　　2.性激素水平:与对照组相比,在NASH组中,睾酮、LH和SHBG显著下降,而FSH明显升高;在NAFLD组中SHBG水平同样低于对照组,而FSH水平也高于对照组(P<0.05),其他指标均无显著性差异;NASH组与NAFLD组相比,LH和SHBG水平下降更为明显。
　　3.精子质量分析:NAFLD成年男性精子常规参数的均值:精液量,2.9 mL;精子密度,65.3×106/mL;精子数,124.8×106;a级精子%,33.8%;(a+b)级精子%,53.1%;正常形态精子百分比,27.9%。其中精子密度、精子计数和精子活性均显著低于对照组,其他指标均无统计学差异。
　　4.多因素分析:禁欲时间和NAFLD是精子参数的影响因素,随着禁欲时间的延长,精液体积、精子密度和精子数有明显上升;随着肝脏脂肪含量的增加,精子密度、精子数和精子活性显著降低。年龄、BMI、吸烟和饮酒对重庆市社区成年男性的精子参数无显著影响。
　　第二部分非酒精性脂肪性肝病对雄性SD大鼠生殖功能的影响
　　1. NAFLD大鼠模型:NAFLD组大鼠外观明显肥胖,体重增加,肝脏显著增大, HE和油红O染色见大量脂滴沉积,随造模时间延长,脂肪变程度逐渐加重,血清TC、TG、ALT在NAFLD组亦显著升高。
　　2.激素水平和睾丸形态学:NAFLD组中血清睾酮、SHBG、LH和IGF-1水平显著低于对照组,且睾丸中合成睾酮也明显减少。NAFLD组中睾丸、附睾和前列腺等性腺器官脏器系数明显降低,睾丸中曲细精管细胞层数减少,生精细胞出现大量脂滴,空泡化、细胞间隙增大,部分细胞从基膜脱落。
　　3.精子质量分析:NAFLD组中精子数目和(a+b)级的精子所占百分比减少,而精子的畸形率无明显变化。流式检测发现,成熟的精子细胞减少,初级精母细胞减少,减数分裂减慢,NAFLD可能对精子细胞的早期分化产生影响。凋亡检测提示NAFLD组中生殖细胞凋亡数目明显增多,说明NAFLD可能影响生殖细胞的凋亡。
　　4.繁殖实验:NAFLD雄鼠致雌鼠怀孕时间明显延长,而怀孕率、活胎率、死胎率和吸收胎率均无显著差异,说明NAFLD对雄鼠生育能力无不良影响。仔鼠出生存活率、出生体重、出生7天存活率和出生7天体重等指标表明F1代生长发育也未受明显影响。
　　5. N-3 PUFA治疗作用:N-3 PUFA治疗4周后,NAFLD大鼠血清激素水平部分升高,睾丸中脂滴和空泡化数目也相对减少,精子数目和精子活性也有不同程度恢复,表明N-3 PUFA对NAFLD诱导的大鼠生殖损伤具有一定保护作用。
　　第三部分非酒精性脂肪性肝病雄性生殖损伤的机制探讨
　　1.睾酮合成限速酶:NAFLD可导致 StAR、P450scc、17βHSD和P45017α mRNA和蛋白表达水平下降。NAFLD可显著降低AC活性和cAMP含量,而对LHR mRNA和蛋白的表达水平无明显影响,提示NAFLD是通过降低血清中LH的水平,减少LH与LHR的结合,进而影响AC-cAMP-PKA途径,最终导致睾酮合成酶基因转录和表达水平降低。
　　2. N-3 PUFA治疗作用:经过4周 N-3 PUFA治疗,AC活性和cAMP含量均有不同程度的升高,而睾酮合成酶的表达水平无显著变化,表明N-3 PUFA可以部分恢复AC-cAMP-PKA途径活性。
　　结论:
　　1.本研究首次检测了我国男性NAFLD人群的精子质量,发现肝脏中脂肪含量的升高与性激素水平异常和精子质量下降密切相关,并证实NAFLD是影响精子质量的危险因素,需要引起人们的高度重视。
　　2. NAFLD诱发睾丸形态学改变,如细胞凋亡增加和间质细胞减少,导致睾丸中睾酮合成减少而影响生殖功能,表现为精子数量和精子活性下降,而对精子形态和 F1代的生长发育无影响。
　　3. NAFLD可导致血清中LH水平下降,减少LH与LHR的结合,进而抑制AC-cAMP-PKA通路,影响睾酮合成限速酶基因(StAR、P450scc、17βHSD和P45017α)的转录表达。
　　4.N-3 PUFA对NAFLD诱导的生殖功能损伤具有一定的保护作用,并且也是通过激活AC-cAMP-PKA通路发挥作用,为临床提高NAFLD患者的生活质量提供实验依据。
　　本研究结果显示NAFLD对男性生殖功能有一定程度的影响,表现在精子数量和精子活性的下降,应加强对NAFLD防治,确保人民的生殖健康。同时发现NAFLD是通过抑制AC-cAMP-PKA通路,降低睾酮合成限速酶基因的转录表达,进而影响生殖功能,为临床治疗提供新的靶点,上述内容经过文献检索,国内外尚未见类似的研究报道。
　　同时本研究也存在一些不足,如研究人群样本量较小、依从性不高、均来源于社区,研究结果可能与NAFLD对普通人群生殖功能影响存在差异;对F1代的影响,只记录了7天的生长发育情况,可能低估了NAFLD对下代的生长发育影响;在机制探讨中,只检测了LHR mRNA和蛋白水平及下游AC-cAMP系统的活性,并未直接检测LH与LHR的结合情况,可能会影响到数据的完整性。
　　在今后的研究中,可以考虑深入探讨NAFLD导致血清中LH水平下降的机制,如NAFLD对血清LH代谢情况或者对下丘脑-垂体-性腺轴调节;另外,还可在NAFLD动物模型的睾丸组织中,检测线粒体通路、内质网应激、脂肪酸代谢和糖代谢等通路的变化情况,进一步探索NAFLD影响男性生殖功能的分子机制。

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缩略语表

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非酒精性脂肪性肝病对男性生殖功能的影响及机制探讨

第一章 前 言

第二章 非酒精性脂肪性肝病男性患者生殖健康的流行病学调查

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 非酒精性脂肪性肝病对雄性SD大鼠生殖功能的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 非酒精性脂肪性肝病对雄性生殖损伤的机制探讨

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文总结

参考文献

文献综述

附 件

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