一种新型抗体静置孵育装置及Kir2.1促胃癌干细胞侵袭转移

摘要

第一部分:新型免疫印迹法抗体表面静置孵育实验装置的应用效果
　　我们设计了一个新的免疫印迹抗体孵育湿盒可以克服传统孵育湿盒的缺点。该装置由盛水加盖的外盒和一个具疏水平面且可漂浮的内置物构成,漂浮的内置物可保证水平,疏水平面可防止敷于偏氟乙烯薄膜(PVDF)或硝酸纤维素薄膜(NC)上的抗体弥散,盒中的水保证盒内湿度防止抗体溶液的蒸发。我们在实验中应用了该实用新型,并且该实用新型于2013年获得中国国家知识产权局的授权(专利号 ZL201320144341.7)。
　　第二部分:Kir2.1在胃癌干细胞干性维持和侵袭转移中作用的研究
　　胃癌是世界范围内高发病率、高致死性的恶性消化系统肿瘤之一。尽管近年来胃癌的手术、化疗以及其他治疗方法均取得了长足进步,但其疗效仍不尽如人意,5年生存率并未得到显著提高。这一现象折射出人们对胃癌侵袭转移机制的认识还不够深入。因此,深入进行胃癌侵袭转移机制的研究是当前一项紧迫的任务。
　　肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)学说的提出是近几年来肿瘤研究领域的一大进展,也为我们认识胃癌侵袭和转移机制开拓了新的视角。愈来愈多的证据表明,CSCs是肿瘤侵袭转移的“种子”细胞。我们小组之前通过无血清成球培养的方法分离/富集了胃癌干细胞(gastric cancer stem cells, GCSCs),并发现其具有高度自我更新和侵袭转移潜能,从而证明了GCSCs是胃癌侵袭转移的细胞学基础。然而GCSCs侵袭转移的机制并不清楚。
　　近年来,钾离子通道在肿瘤中的作用受到关注,为探讨钾离子通道是否在GCSCs干性维持及侵袭转移中发挥作用,我们进行了全细胞电压膜片钳实验,发现 GCSCs中内向整流 K+电流显著高于非 GCSCs。然而,钾离子通道种类繁多,为确定何种钾离子通道发挥主要作用,我们进一步作了基因表达谱芯片分析,结果显示内向整流K+通道Kir2.1(potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member2,KCNJ-2)在GCSCs中显著高表达。我们还应用免疫组化方法检测了临床胃癌标本中Kir2.1表达,并统计分析了Kir2.1表达与临床病理参数及病人预后的关系。本研究主要方法、结果及结论如下:
　　1、胃癌干细胞产生高强度内向整流钾电流与高表达Kir2.1密切相关
　　(1)我们选择胃癌细胞系中转移能力较强的细胞系 SGC7901,按本组先前建立的无血清成球培养法分离/富集GCSCs,然后以全细胞电压膜片钳检测其K+电流的产生。结果发现,相比单层生长细胞(monolayer cells,MN),胃癌细胞球细胞(sphere cells, SC)即GCSCs在电压的刺激下可以释放更高强度的内向整流K+电流。
　　(2)基因表达谱芯片分析结果表明,GCSCs较MN显著高表达Kir2.1通道蛋白(基因名:KCNJ-2)的mRNA并得到qRT-PCR验证。
　　(3) Western blot实验从蛋白水平证明 GCSCs高表达 Kir2.1,免疫荧光实验显示Kir2.1通道蛋白主要表达在细胞膜但也存在于细胞质中。
　　(4) qPCR进一步证明只有能产生特征性内向整流 K+电流的胃癌细胞才能检测到KCNJ-2基因的表达,而在没有特征性内向整流 K+电流的胃癌细胞中则检测不到KCNJ-2基因的表达。这些结果表明,GCSCs产生高强内向整流K+电流,并且该电流的产生主要由于其高表达内向整流K+通道Kir2.1所致。
　　2、Kir2.1+胃癌细胞具有干性特性和高侵袭能力
　　(1)流式细胞仪分析发现 SGC7901细胞中 Kir2.1阳性(Kir2.1+)细胞的比率约为7.5％。
　　(2)与 Kir2.1-细胞相比较,Kir2.1+细胞高表达干性转录因子 Nanog,具有更强的细胞球(tumor-sphere)和克隆形成能力,表明Kir2.1+细胞具有干性特性。
　　(3)活细胞工作站观察结果显示Kir2.1+细胞较Kir2.1-细胞具有更强的运动能力, Transwell小室迁移实验显示Kir2.1+细胞较Kir2.1-细胞具有更强的迁移能力,qRT-PCR检测还表明 Kir2.1+细胞较 Kir2.1-细胞高表达基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP2)。
　　3、siRNA沉默Kir2.1的表达抑制胃癌细胞干性和侵袭能力
　　应用靶向Kir2.1的siRNA敲低Kir2.1的表达后,胃癌细胞Nanog和MMP2的表达均显著下调,体外迁移和侵袭能力也受到显著抑制。
　　4、Kir2.1在胃癌标本中表达与病人预后密切相关
　　(1)应用免疫组化染色方法检测了212例胃癌标本中 Kir2.1的表达,发现 Kir2.1的表达与胃癌患者年龄(P=0.674)、性别(P=0.329)、组织学分型(P=0.625)无关,而与浸润深度(P=0.010)、TNM分期(P=0.002)和是否发生淋巴结转移(P=0.028)呈正相关。
　　(2)采用Kaplan-Meier方法计算132例有随访资料病人的生存率,结果显示高表达Kir2.1的患者预后差于低表达Kir2.1的患者,提示Kir2.1可以用作判断胃癌患者预后的指标。
　　该部分的主要结论如下:胃癌干细胞高表达内向整流K+通道Kir2.1,并与其干性维持和侵袭能力密切相关;Kir2.1的表达与胃癌浸润深度、TNM分期和淋巴结转移呈正相关而与患者生存时间呈负相关,可能成为判断胃癌预后的新的指标。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 新型免疫印迹法抗体表面静置孵育实验装置及其应用

2.1 装置结构

2.2 应用效果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 Kir2.1在胃癌细胞干性维持和侵袭转移中的作用

1.1 材料方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

第二节 Kir2.1维持胃癌干细胞干性和促侵袭作用

第三节 Kir2.1在人胃癌组织的表达及其临床意义

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

致谢