MHE对P糖蛋白底物体内行为的影响及作用物质基础初探

摘要

目的：
　　醋柴胡小分子水溶性部位（micromolecular hydrophilic extract from vinegar baked Radix Bupleuri，MHE）是醋柴胡水提液经80％醇沉去掉多糖和正丁醇萃取后的水溶性部位，前期实验证明其是疏肝解郁的有效部位，体外实验中证明其可抑制P糖蛋白的基因表达和蛋白表达，提高Pgp-HEK293细胞对底物的摄取。本文将探讨MHE对P糖蛋白引起的多药耐药和药物相互作用的影响，并初步鉴定MHE中所含有的成分。
　　方法：
　　1.采用耐药细胞模型考察MHE逆转因P糖蛋白导致的多药耐药现象。利用MTT法考察受试药物MHE、维拉帕米对MES-SA和宫颈癌耐药细胞株MES-SA/MX2细胞的毒性影响，获得安全给药范围；考察MHE联用阿霉素对MES-SA/MX2的毒性影响，确定MHE的逆转倍数。采用流式细胞术考察MHE对P糖蛋白底物罗丹明123的蓄积的影响，探讨其体外对于P糖蛋白活性影响。
　　2.药物动力学方法考察MHE对P糖蛋白底物地高辛体内行为的影响。首先考察不同剂量组MHE对地高辛药物动力学的影响，大鼠灌胃给药后分别于给定时间点采血，测定其中药物浓度，比较联用MHE后地高辛药动学参数的变化。其次考察MHE对地高辛体内分布的影响。大鼠给予药物后，于给定时间点处死，收集脏器，测定其中药物浓度，比较联用前后地高辛组织内药物浓度的变化。
　　3.通过考察组织内转运蛋白表达探讨MHE影响地高辛体内过程的机制。实时荧光定量PCR测定大鼠地高辛5 min，15 min，3 h单用组和联用组的肝、肾、小肠、心的P糖蛋白和Oatp2的mRNA相对表达量，并比较其差异。
　　4.MHE影响地高辛体内行为的物质基础通过对其中成分进行分析进行初步探讨。其中利用三甲基硅烷衍生化GC-MS测定其中糖类等成分，利用AQC衍生化HPLC-UV鉴定MHE游离氨基酸种类。
　　结果：
　　1.MHE、维拉帕米的安全给药范围分别为50 mg/mL生药浓度和10μM；1 mg/mL，10 mg/mL生药浓度的MHE和1μM维拉帕米对MES-SA/MX2细胞的逆转倍数分别为0.23，0.42，9.49。相比对照组，不同剂量的MHE对Rh123的相对摄取率均没有显著影响。
　　2.地高辛线性范围为0.156~50 ng/mL，提取回收率为70.19~98.99%、基质效应为96.08~114.2%、准确度范围为85.7~114.3%，内日间精密度RSD小于15%，稳定性RSD小于15%。与单用组相比，低剂量联用组地高辛的AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-t)分别降低了31.54%，24.92%，24.42%（P<0.05），CLz/F增加了29.60%；高剂量联用组地高辛的AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-t)的分别降低了42.98%（P<0.01），36.31%（P<0.01），21.81%（P<0.05），CLz/F增加了59.02%（P<0.05）。MHE显著改变地高辛的体内分布，增加其在肝脏的分布，减少其在小肠和血液中的分布，不影响心、肾药物浓度。肝脏的相对摄取率RUE增加14.1%，小肠和血浆的RUE分别降低58.1%和36.5%，心、肾的RUE几乎不变；肝脏、肾、心的相对摄取率RTE分别为76.9%，57.1%，52.6%，小肠的RTE为-35.0%。
　　3.与单用组相比，联用组的肝脏P糖蛋白mRNA的表达量在5 min时显著下降（P<0.05）；而Oatp2的mRNA的表达量在3h时上升（P<0.05）。肾脏P糖蛋白 mRNA的表达量在5 min，15 min时显著下降（P<0.05），Oatp2 mRNA的表达量在3h时显著降低（P<0.05）。小肠P糖蛋白mRNA在3h时显著提高，P<0.05。其余脏器和时间点的P糖蛋白和Oatp2的表达均没有显著性差异。
　　4.MHE主要含有5种寡糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露二糖、龙胆二糖；10种单糖（含糖醇和醛酸）：木糖醇、山梨糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-果糖、D-甘露醇、景天庚酮糖、D-阿拉伯吡喃糖、D-核糖；5种有机酸：琥珀酸、醋酸、丙二酸、丁二酸、延胡索酸；其余：十六烷醇、肌醇、顺式-13-十八烯酸、11-顺式-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、十八烷酸、且含有18种合成人体蛋白质的氨基酸和γ-氨基丁酸。
　　结论：
　　在体外实验中MHE并不能逆转MES-SA/MX2细胞株上基于P糖蛋白的耐药现象，然而在体内药物动力学以及体内分布实验显示MHE显著影响了P糖蛋白底物地高辛的药物动力学行为以及体内分布，而这种影响与组织Pgp的表达量有关，提示临床上醋柴胡或小分子水溶部位与P糖蛋白底物联合应用时应密切关注其疗效和毒性。MHE含有多种单糖、寡糖、氨基酸类成分、然而其哪些是其有效成分还有待进一步探讨。

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第一章 绪论

1.柴胡的研究进展

2.P糖蛋白的研究进展

3.选题的内容和意义

第二章 MHE对MES-SA/MX2细胞株上P糖蛋白的活性影响

1.材料

2.实验方法和结果

3.讨论

第三章 MHE对大鼠体内地高辛的药物动力学影响

1.材料

2.方法与结果

3.讨论

第四章 MHE对大鼠组织中地高辛的影响

1.材料

2.方法与结果

3.讨论

第五章 MHE联用地高辛对大鼠组织中的P糖蛋白与Oatp2 mRNA表达的影响

1.材料

2.方法和结果

3.讨论

第六章 三甲基硅烷化GC-MS研究MHE的有关成分

1.材料

2.方法与结果

3.讨论

第七章 AQC衍生化HPLC-UV研究MHE的游离氨基酸种类

1.材料

2.方法与结果

3.讨论

结论和展望

一、结论

二、展望

参考文献

附 录

攻读硕士期间发表论文

致谢