调节性T细胞在自身免疫性卵巢早衰发生发展中的作用

摘要

研究背景及目的:
　　卵巢早衰(Premature Ovarian Failure)是指女性40周岁之前因性腺功能衰竭,伴促性腺激素增高、雌激素低下,可有一系列围绝经的临床表现,如潮热、多汗、不孕等症状。40岁以下女性的发病率约为1％,在30岁以下女性的发病率约为0.1%,在20岁以下女性的发病率约为0.01%。POF患者不仅生育力低下,且易提前出现骨质疏松、心血管疾病及帕金森等并发症,癌症相关发病率增高1.29倍,合并自身免疫系统疾病增高1.56倍,死亡率高达普通人群的两倍。因此,对卵巢早衰的研究越来越受到临床关注。
　　目前,POF病因和发病机制仍不十分清楚。染色体变异,自身免疫、代谢异常或药物作用、放射损害、病毒感染等因素可能与POF的发生有关。自1968年有学者提出POF与自身免疫性疾病有关,迄今认为30%的病因与自身免疫调节异常相关.而自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease AOD)可能是POF发病的免疫学机制,AOD疾病的病理学表现为炎性细胞对卵巢内卵泡及间质的侵润,致使卵巢结构紊乱,卵泡缺失,闭锁。新生期第2-5天切除易感品系小鼠胸腺可以诱导AOD的发生。胸腺是CD4+T淋巴细胞分化、发育和成熟的场所,胸腺来源的具有免疫抑制作用的CD4+CD25+T,称为调节性T细胞(Regulatory T cells Treg)能够调节天然和适应性免疫应答,参与免疫负调节和免疫耐受,对机体免疫环境的稳定起到重要作用。因此探讨CD4+CD25+调节性T细胞( Regulatory T cells,Treg)在自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease AOD)的发病机制十分重要,为人类POF的诊断、发病机制及其治疗方法提供线索。
　　研究方法:
　　出生第3天乳鼠行胸腺摘除术(Thymectomized on day3 of life,D3tx)建立D3tx组和假手术组,免疫组织化学观察小鼠卵巢形态学改变, ELISA检测血清性激素变化,流式细胞学检测D3tx术后不同时期小鼠外周血Treg比例变化及AOD小鼠外周血及不同区域淋巴结中T细胞亚群和Treg细胞百分比的变化。并通过免疫磁珠分选出CD4+CD25+T细胞,过继转移到D3tx小鼠体内,观察疾病的转归情况。
　　结果:
　　1) ELISA检测术后5-9周小鼠血清性激素变化,结果显示D3tx小鼠FSH明显高于假手术组,E2、LH显著低于假手术组。
　　2)免疫组织化学染色结果显示 D3tx小鼠在术后第5周卵巢开始出现炎细胞的侵润及卵泡闭锁,随时间的推移,炎细胞侵润及闭锁卵泡数目明显增加,卵泡结构层次更加紊乱,疾病严重程度逐渐加剧,到第8周时81.5%的卵巢病理表现为4级。
　　3)流式细胞检测不同时期小鼠外周血中 Treg/CD4+的比例,结果显示 D3tx小鼠术后1-2周外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+快速上升,到第2周时达到峰值,后快速下降至第3周,此后逐渐缓慢下降,至第9周时仍高于假手术组。
　　4)流式细胞检测AOD小鼠外周血及不同淋巴结中T淋巴细胞亚群和Treg细胞百分比的变化,结果显示,AOD小鼠体内CD3+/lymphocyte在外周血及不同淋巴结中均明显低于假手术组,但 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+在外周血及不同淋巴结中均明显高于假手术组。
　　5)经免疫磁珠分选后,提取高纯度Treg过继转移至术后3天的D3tx小鼠体内,术后8周,血清性激素提示Treg过继转移后小鼠FSH明显下降,E2明显增高。卵巢切片经免疫组织化学染色后卵巢内可见卵泡,且卵巢区域淋巴结来源的 Treg对预防AOD发生的效果更加显著。
　　6)流式细胞学检测Treg过继转移后小鼠外周血及不同淋巴结中T淋巴细胞亚群和 Treg细胞百分比的变化。结果发现过继转移组小鼠外周血及脾脏中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值明显高于未过继转移小鼠,但在腹主动脉旁淋巴结及腹股沟淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+无统计学差异。Treg过继转移后小鼠与未过继转移组小鼠在外周血、脾脏、腹主动脉旁淋巴结及腹股沟淋巴结中 CD3+/lymphocyte、CD4+/CD3+、CD8+/CD3+、CD4+/CD8+的比值均无明显统计学差异。
　　结论:
　　D3tx小鼠诱导的自身免疫性卵巢疾病在血清性激素及卵巢形态学改变均与人类POF相似,可以作为人类研究自身免疫性POF动物模型。AOD表现以T淋巴细胞持续减少为主,伴有外周血和淋巴组织中 CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例增高及卵巢内CD4+、Foxp3+表达上调。推测D3tx小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+/CD4+增高可能是外周免疫器官内静息的CD4+T细胞被诱导分化成iTreg,参与局部炎症反应,抑制自身反应性T细胞,但是D3tx小鼠体内增高的自身内源性Treg可能不足以抑制自身反应性T细胞增殖,则导致AOD的发生。过继转移正常雌鼠CD4+CD25+Treg至D3tx体内, Treg的大量增加至完全能够抑制自身反应性T细胞时, AOD的发生得到有效的抑制;且卵巢区域淋巴结来源的CD4+CD25+Treg具有更强大的抑制作用,提示AOD的发病机制可能与CD4+CD25+Treg识别特异性自身卵巢抗原相关。

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缩略语表

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第一章 前 言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 小鼠自身免疫性卵巢早衰模型的建立

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

第三章 调节性T细胞在小鼠自身免疫性卵巢早衰中的变化

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 调节性T细胞对小鼠自身免疫性卵巢早衰的干预作用

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢