TSSC3/RanBP9调控骨肉瘤失巢凋亡及EZH2促进骨肉瘤增殖并影响TSSC3表达的分子机制

摘要

骨肉瘤是最常见的骨组织恶性肿瘤，它是导致儿童和青少年癌症相关死亡的第二位原因。近年来由于新辅助化疗的临床应用，有效地改善了患者的5年有效生存率。但是，骨肉瘤的致死率和致残率仍然很高，近20年骨肉瘤的治疗进展十分缓慢。因此，目前亟需开发更具靶向性的新的治疗骨肉瘤的方法。
　　肿瘤的转移是一个复杂的多步骤事件，失巢凋亡抵抗是肿瘤细胞发生转移的先决条件，与化疗药物抵抗性和不良预后相关。因此探讨骨肉瘤细胞的失巢凋亡抵抗、化疗药物抵抗和远处转移的机制将为深入阐明骨肉瘤的肺转移及耐药提供进一步的理论和实验依据。
　　印迹基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)是我课题组利用基因芯片技术在成骨细胞恶性转化过程中筛选出的差异表达明显的基因，它在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。TSSC3可以在体内和体外抑制骨肉瘤细胞的增殖，但是TSSC3参与调控骨肉瘤失巢凋亡以及肺转移的相关分子机制并不明确。而作为印迹基因，TSSC3的表达主要受表观遗传学机制的调控，EZH2(enhancer ofzeste homolog2)是介导组蛋白甲基化修饰的关键表观遗传学调控因子，它是否参与调控并抑制TSSC3在骨肉瘤中的表达，目前并无相关报道。
　　因此，本课题共分为以下两个部分:
　　第一部分拟采用酵母双杂交系统钓取与TSSC3发生相互作用的蛋白，并采用免疫共沉淀、酵母双杂交方法验证两蛋白的相互作用，明确介导二者相互作用的关键结构域;并进一步利用共转染差异表达TSSC3和其相互作用蛋白RanBP9，明确TSSC3与其相互作用蛋白(RanBP9)在骨肉瘤失巢凋亡和转移中的作用和相关分子机制。
　　第二部分拟采用免疫组化和qRT-PCR检测骨肉瘤细胞和组织中EZH2和TSSC3表达，并对EZH2对骨肉瘤生物学效应的影响以及TSSC3在其中的作用进行初步研究，目的在于阐明骨肉瘤中EZH2和TSSC3的表达及生物学意义，以及EZH2对TSSC3的表观遗传学调控，以期为骨肉瘤的表观遗传学治疗提供初步的理论基础。
　　主要研究结果如下:
　　第一部分:
　　1.RanBP9是TSSC3在骨肉瘤细胞中新的相互作用蛋白，二者的相互作用由RanBP9的SPRY结构域和TSSC3的PH结构域介导，且二者在转录水平和翻译后水平均存在相互调节的作用。
　　2.TSSC3/RanBP9的表达与骨肉瘤细胞的高迁移、侵袭和失巢凋亡抵抗等表型呈负相关。
　　3.TSSC3/RanBP9表达与骨肉瘤患者肺转移亦呈负相关。
　　4.RanBP9与TSSC3在体外实验中协同抑制了骨肉瘤细胞的锚着依赖生长、侵袭迁移并促进细胞凋亡，并在体内实验中显著抑制了骨肉瘤的肺转移。
　　5.RanBP9的SPRY结构域在TSSC3/RanBP9复合物介导的失巢凋亡抵抗效应中起重要作用
　　6.RanBP9发挥其支架蛋白的作用与Src、TSSC3形成一个三聚体，而后抑制Src以及Src介导的Akt通路的激活，并促进内源性线粒体途径介导的失巢凋亡。
　　综上所述，我们发现了一个新的可以和TSSC3发生相互作用的蛋白RanBP9，且TSSC3和RanBP9协同抑制骨肉瘤的失巢凋亡抵抗和侵袭转移，该过程是由依赖Src的PI3K/Akt通路介导的。因此，RanBP9和TSSC3可能均在骨肉瘤中发挥抑癌基因的作用。该部分结果可以为以RanBP9和TSSC3双靶点的骨肉瘤治疗提供初步的理论基础。
　　第二部分:
　　1.EZH2在人骨肉瘤组织和细胞中呈异常高表达。
　　2.EZH2与骨肉瘤临床病理学参数的相关性:EZH2与骨肉瘤临床分期、分级和远处肺转移显著相关，同时EZH2的表达与TSSC3呈负相关。
　　3.敲低EZH2的表达可以在体内和体外抑制骨肉瘤细胞增殖。
　　4.抑制EZH2可以促进骨肉瘤细胞凋亡，抑制其侵袭迁移能力。
　　5.敲低EZH2可以抑制骨肉瘤的肺转移。
　　6.抑制EZH2的表达，可以通过抑制骨肉瘤细胞增殖和促进细胞凋亡增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
　　7.沉默EZH2可以上调TSSC3的表达，EZH2可能通过组蛋白27位赖氨酸的三甲基化(H3 K27me3)介导TSSC3的表达沉默。
　　8.EZH2通过抑制TSSC3的表达发挥其促癌作用。
　　综上所述，EZH2在骨肉瘤中异常高表达，且敲低EZH2后可以在体内和体外显著抑制骨肉瘤的增殖和侵袭能力，而敲低EZH2的上述生物学效应与其对印迹基因TSSC3的表观沉默作用相关。因此，EZH2可能在骨肉瘤中起癌基因的作用，促进肿瘤的发生发展。该部分实验可以为骨肉瘤的表观治疗提供一些初步的理论基础。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 印迹基因TSSC3与RanBP9协同调控骨肉瘤失巢凋亡及侵袭转移的分子机制研究

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 第一部分总结

第二章 敲低EZH2通过上调TSSC3的表达抑制骨肉瘤的增殖及转移的研究

2．1 前言

2．2 实验仪器和材料

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 第二部分总结

全文总结

参考文献

文献综述一 骨肉瘤的研究进展

文献综述二 EZH2在肿瘤中的生物学作用及靶向EZH2的表观遗传学药物

攻读博士学位期间发表和投稿的论文

致谢