Frizzled4在小鼠毛囊生长周期中角质形成细胞的表达及其功能研究

摘要

毛囊是皮肤组织重要而复杂的附属器官,它由上皮和真皮成分组成,上皮成分包括毛母质、外根鞘和内根鞘,真皮成分包括毛乳头和真皮鞘。从细胞的组成上讲毛囊包括了角质形成细胞、毛乳头细胞、真皮鞘细胞、黑素细胞及Langerhans细胞等20多种细胞。毛囊的发育、生长及周期变化是通过上皮和真皮的相互对话、相互作用而实现。根据毛囊生长形态的变化,毛囊周期分为三个阶段:生长期,退化期及静止期。多种活性蛋白、细胞因子、激素参与了毛囊周期性生长的调节,同时它也受到多种信号途径的调控,目前研究较多的是Wnt、Bmp、Shh及Notch信号等,其中Wnt信号通路是维持毛囊周期性生长的重要信号通路,Wnt蛋白通过与Wnt信号的Frizzled受体结合影响了下游的信号传递和靶基因的激活。Wnt信号受体Frizzled蛋白在毛囊中的定位反映着Wnt信号的作用部位,因而在毛囊的周期性变化过程中同样也发挥着重要作用。到目前为止在脊椎动物中发现了至少10个Frizzled家族成员,对于它们的研究目前也并不清楚,已有关于Frizzled1、2、3、5、6、7、10在毛囊生长期中研究,但对其在毛囊周期中的变化及作用未做进一步研究,另外有文献表明Frizzled4表达于毛囊黑色干细胞中,但对于Frizzled4是否在毛囊角质形成细胞的表达及其功能尚未见报道。
　　目的
　　初步探讨 Frizzled4在毛囊生长周期中毛囊角质形成细胞中的表达规律及其在毛囊中的可能作用。
　　方法
　　本研究从以下几个方面展开实验:取生长期早期——出生后1d(P1d)和P3d,生长期中期P8d,退化期P16d和静止期P21d的C57BL/6雌性小鼠背部皮肤,采用免疫荧光(immunofluorescence,IF)、实时定量PCR和RT-PCR、Western blot等多种实验手段检测Frizzled4在小鼠毛囊周期中的表达;通过免疫荧光检测角蛋白K14与Frizzled4在毛囊中是否存在共表达,以确定Frizzled4是否存在于毛囊角质形成细胞中;针对体外功能研究实验,以小鼠皮肤上皮细胞JB6 cl30-7b为研究对象,首先利用免疫荧光技术检测了Frizzled4蛋白在JB6 cl30-7b细胞膜上表达,然后利用抗Frizzled4抗体(1:100)对小鼠皮肤上皮细胞干预后采用MTT、BrdU检测细胞的增殖情况;最后利用拔毛模型来诱导毛囊再生,利用免疫荧光来检验Frizzled4在再生毛囊周期(拔毛后P5d、P10d、P20d及P25d)中的表达,探讨再生过程中Frizzled4的表达规律。
　　结果
　　一、Frizzled4在毛囊周期中表达变化
　　1、免疫荧光检测Frizzled4蛋白的定位,结果显示Frizzled4蛋白表达于毛囊角质形成细胞的细胞中,其表达部位随着周期变化而变化:在生长期 Frizzled4蛋白主要分布于毛囊 Bulge部位、外根鞘、毛球部外侧、内根鞘、前皮质(precortex),且随着毛囊的生长分化,表达量逐渐增多。在退化期Frizzled4表达量减少,主要表达于Bulge、外根鞘上段、部分内根鞘。到了静止期只有少许阳性细胞集中在毛囊Bulge处。
　　2、Western blot检测Frizzled4蛋白在毛囊周期皮肤中表达量的变化,结果显示:Frizzled4蛋白在小鼠出生后的第一天(P1d)的背部皮肤中就表达较明显,在第三天(P3d)Frizzled4蛋白表达明显上调。与P3d相比,P8d小鼠背部皮肤中Frizzled4蛋白的表达继续上调。随后在退化期(P16d),Frizzled4蛋白表达下调显著。当毛囊进入静止期(P21d),小鼠背部皮肤中 Frizzled4蛋白表达微弱,明显低于 P1d、P3d、P8d、P16d。
　　3、荧光定量PCR、半定量RT-PCR检测Frizzled4 mRNA在不同毛囊周期皮肤中表达量的变化,结果显示Frizzled4 mRNA表达和蛋白的表达趋势基本一致,表现为生长期最丰富,退化期减弱,静止期最低。
　　二、在细胞水平检测Frizzled4对毛囊角质形成细胞增殖的影响
　　1、细胞免疫荧光检测Frizzled4蛋白的表达,结果显示Frizzled4表达于小鼠皮肤上皮细胞JB6 cl30-7b的细胞膜。
　　2、在JB6 cl30-7b细胞培养液中分别加入5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的Frizzled4抗体,以相同浓度的同型IgG作为实验对照,24h后利用MTT检测吸光度值。MTT结果显示:与对照组相比,5μg/mL抗Frizzled4抗体处理的细胞其吸光度值没有显著变化,而10μg/mL抗Frizzled4抗体处理后吸光度值明显降低,20μg/mL抗Frizzled4抗体处理后的吸光度值降到最低。结果表明抗Frizzled4抗体促使JB6 cl30-7b细胞增殖能力降低,且随着浓度的增加,对细胞的增殖抑制越明显。
　　3、BrdU结果显示,抗Frizzled4抗体同样使JB6 cl30-7b细胞增殖能力降低。
　　三、外因诱导下Frizzled4在毛囊中的表达
　　Frizzled4蛋白在外因诱导下的毛囊再生中的表达与毛囊生长一致(即在生长期表达最多,到退化期表达降低,在静止期表达最低),与自然周期表达基本一致。
　　结论
　　本课题首次检测了Frizzled4蛋白在小鼠毛囊周期中毛囊角质形成细胞中的表达,通过体外细胞水平和动物在体水平,探索了其在角质形成细胞中的作用,为下一步继续深入研究并确定与Frizzled4结合的Wnt蛋白及其激活的下游信号通路做好了铺垫,为毛发生长以及毛囊再生的调控研究提供一定的理论依据。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 Frizzled4在小鼠毛囊生长周期中角质形成细胞的表达规律

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 体外干扰Frizzled4对毛囊生长的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 外因诱导下Frizzled4在毛囊周期中的表达

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

全文总结

参考文献

文献综述

攻读硕士期间发表的论文

致谢