转录因子Foxo1和天然产物PL-C对NK细胞发育与功能的调控作用及机制研究

摘要

NK细胞是机体天然免疫的关键组分，占外周淋巴细胞的5～10％。它是机体免疫防御的第一道防线，在早期恶性转化的细胞、病毒和胞内寄生菌、真菌的清除以及母胎界面的形成中具有关键作用。NK细胞的这些作用既可通过直接的细胞毒杀伤作用，也可通过其分泌的细胞因子如IFN-γ等参与调控适应性免疫而实现。
　　小鼠NK细胞的发育主要源自于骨髓的造血干细胞，经共同淋巴祖细胞向NK祖细胞分化(precursor NK，pNK，CD122+NK1.1-DX5-)。pNK通过不成熟NK细胞(immature NK，iNK，CD122+NK1.1+DX5-)向成熟NK细胞(mature NK， mNK，CD122+NK1.1+DX5+)发育。当小鼠NK细胞获得表面标志NK1.1分子后，根据表面受体CD11b和CD27的表达水平，依次由CD11b-CD27+向CD11b+CD27+而最终形成CD11b+CD27-终末成熟NK细胞。
　　NK细胞发育与功能的正常发挥依赖于内源性、外源性因子;正向、负向转录因子的相互平衡。外源性因子主要包括正向的介素-15（IL-15）和负向的转化生长因子-β(TGF-β)，而内源性的转录因子主要包括调控NK细胞早期发育、促进pNK形成的Ikaros，Pu.1，Ets1和维生素D3调节蛋白1(VDUP-1);促进iNK形成的E4BP4，Id2和MEF;促进NK细胞终末成熟的GATA3、Tbx21、Eomes和Irf2。但是目前这些发现的转录因子均为正向调控NK细胞发育与成熟，而对NK细胞的内源性负性调控因子的认识仍处于初始阶段。作为调控NK细胞终末成熟关键的转录因子，Tbx21基因敲除小鼠（Tbx21-/-）终末期CD11b+CD27-NK细胞亚群几乎缺失，但其上游信号通路目前知之甚少。
　　基于上述我们提到的NK细胞发育与功能调控研究领域中的两个关键问题，我们从内源性因子-转录因子Foxo1和外源性因素-天然化合物Phyllanthusmin C(PL-C)两个方面，深入探讨NK细胞发育与功能的调控新机制，并寻找激活NK细胞IFN-γ分泌的新策略、新分子。
　　方法与结果:
　　1.Foxo1对NK细胞发育与功能的调控作用及相关机制研究
　　Foxo1在细胞代谢、细胞周期、凋亡、自噬和抗氧化应激等方面具有重要作用。近期研究发现Foxo1参与造血干细胞、共同淋巴祖细胞的生成，以及T、B细胞的发育与功能的调控，且在不同细胞中对靶基因的调控作用具有高度的细胞背景特异性。但是其在NK细胞中的作用目前尚未见研究报道。我们通过一系列的体内、外模型研究发现:
　　(1) Foxo1缺陷减少了NK细胞向外周淋巴节的归巢，其机制可能与CD62L低表达有关
　　为了研究Foxo1对NK细胞发育与功能的影响，我们首先通过Ncr1iCre小鼠与Foxo1fl/fl小鼠（含有floxed Foxo1等位基因）杂交构建了NK细胞Foxo1特异性敲除(Foxo1△NK)的小鼠模型。Foxo1敲除后对骨髓、脾脏中NK细胞的比例、数量无明显影响，但是显著降低外周淋巴结NK细胞的比例和数量，且显著降低淋巴细胞归巢关键因子CD62L的表达。
　　(2) Foxo1以干细胞内源性的方式抑制NK细胞终末成熟
　　Foxo1△NK小鼠骨髓、脾脏、外周淋巴结和外周血终末成熟CD11b+CD27-NK细胞比例明显增加，CD27表达降低，且终末成熟CD43+KLRG+NK细胞比例增加。通过骨髓移植将野生型小鼠或Foxo1△NK小鼠骨髓细胞移植至CD45.1同背景野生型小鼠中我们发现Foxo1抑制了NK细胞成熟的动力学过程。而通过将野生型小鼠和Foxo1△NK小鼠骨髓细胞以等比例的方式移植至同一Rag2-/-Il2rg-/-小鼠体内构建嵌合体小鼠发现Foxo1以干细胞内源性的方式调节NK细胞的成熟。
　　(3) Foxo1抑制NK细胞IFN-γ分泌和肿瘤直接靶向杀伤作用
　　Foxo1△NK小鼠脾脏细胞在体外被IL-12与IL-18联合刺激后分泌IFN-γ的NK细胞比例无明显改变，但单个NK细胞分泌IFN-γ强度明显增加;人NK细胞株NKL无论是持续过表达、可诱导性表达或敲低Foxo1均以相同的方式影响IFN-γ的生成。
　　Foxo1敲除显著升高小鼠NK细胞对Yac-1的体外直接靶向杀伤作用，而过表达Foxo1显著抑制NKL细胞对靶细胞K562的直接靶向杀伤作用。体内实验进一步证实Foxo1敲除明显抑制了小鼠B16F10细胞在体内向肺脏转移的现象。
　　2.天然化合物PL-C促进人NK细胞IFN-γ分泌及相关机制研究
　　为了寻找更多的NK细胞激活途径，改善目前临床上提高体内IFN-γ水平的治疗策略的毒副作用，本论文通过对近50多种天然化合物单体进行筛选，我们发现了一个源自木酚素植物提取物的小分子化合物Phyllanthusmin C(PL-C)可显著增加人NK细胞IFN-γ的分泌。
　　(1) PL-C促进人CD56bright和CD56dim NK细胞IFN-γ转录和分泌
　　在细胞因子IL-12、IL-15存在或不存在的情况下，PL-C均可增加健康人外周血外周单个核细胞(PMBC)、富集NK细胞中IFN-γ+ NK细胞比例;通过纯化的NK细胞(≥99.5％）进一步分析发现，在IL-12、IL-15存在或不存在的情况下PL-C均可直接促进CD56bright和CD56dim NK细胞IFN-γ mRNA合成和蛋白分泌，且与IL-12具有协同效应。
　　(2) PL-C对人NK细胞直接靶向杀伤作用及T细胞IFN-γ分泌均无明显影响
　　为进一步研究PL-C对NK细胞杀伤功能的影响，我们采用纯化NK细胞进行体外靶细胞直接杀伤实验分析。我们发现NK细胞在IL-12或IL-15存在的情况下，PL-C对NK细胞高毒性的靶细胞K562或低毒性作用的多发性骨髓瘤细胞株ARH-77的直接细胞杀伤作用均无明显影响。
　　为了分析PL-C对人NK细胞IFN-γ分泌是否具有细胞特异性，我们接下来观察了在IL-12或IL-15存在的条件下，PL-C对CD4+和CD8+T细胞的IFN-γ分泌是否有促进作用。结果发现PL-C对CD4+和CD8+T IFN-γ+细胞比例无显著影响。
　　(3) PL-C通过NF-κB信号通路促进NK细胞IFN-γ分泌
　　为进一步研究PL-C促进NK细胞IFN-γ分泌的机制，我们综合分析了既往报道的参与NK细胞IFN-γ分泌的主要信号通路。我们发现在IL-12或IL-15存在的情况下，PL-C对IL-12、IL-15的受体(IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IL-15Rα、IL-15Rβ)及其下游信号通路T-bet、STAT家族等蛋白均无显著影响。而不论IL-12、IL-15是否存在，PL-C均可显著促进NF-κB p65的磷酸化，而对p65 mRNA和总蛋白的表达无明显影响。且NF-κB特异性抑制剂甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)可显著抑制PL-C对人原代NK和细胞株NKL细胞IFN-γ分泌的促进作用。通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验进一步分析发现PL-C可显著促进p65结合到IFNG DNA启动子C3-33PκB位点上。
　　研究结论:
　　1.Foxo1对NK细胞发育与功能的调控及机制:
　　1) Foxo1缺陷导致CD62L低表达而损伤NK细胞向外周淋巴节的归巢;
　　2) Foxo1负向调控NK细胞终末成熟而对NK细胞的早期成熟无明显影响;
　　3) Foxo1抑制NK细胞的IFN-γ分泌功能和肿瘤细胞靶向杀伤作用;
　　4) Foxo1磷酸化介导了促炎因子或肿瘤细胞激活NK细胞过程中的Foxo1转录活性失活，从而释放Foxo1对NK细胞发育与功能的抑制效应;
　　5)通过构建Foxo1敲除、Tbx21半敲除或者全敲的动物模型，证实Foxo1对NK细胞的成熟的抑制作用必需通过其对Tbx21的抑制性调节而实现;
　　6)在人NK细胞中Foxo1直接结合TBX21 DNA启动子区域forkhead共有序列而在小鼠NK细胞中Foxo1被Sp1招募到小鼠Tbx21启动子Sp1的DNA结合位点而抑制Sp1对Tbx21的转录起始作用。
　　2.天然化合物PL-C通过TLR-NF-κB通路选择性促进人NK细胞IFN-γ分泌
　　1) PL-C促进人CD56bright和CD56dim NK细胞IFN-γ转录和分泌且与IL-12具有协同效应，但不影响NK细胞杀伤及T细胞的IFN-γ分泌功能;
　　2) PL-C对IL-12和IL-15的受体及其下游信号通路无明显作用;
　　3) PL-C通过直接激活TLR-NF-κB信号通路而促进NK细胞IFN-γ分泌。
　　总之，通过上述两部分实验，我们发现了首个负性调控NK细胞终末成熟和功能的内源性转录因子Foxo1，且证实了其机制主要是通过且必需通过其对NK关键转录因子Tbx21表达的抑制性调节而实现，极大的丰富了NK细胞发育与功能的负性调控网络;另一方面我们发现了一个特异性激活NK细胞INF-γ分泌功能而不影响NK细胞杀伤功能的天然小分子化合物PL-C，且阐明了其机制是通过其对TLR-NF-κB轴的激动作用而实现的，为基于INF-γ的临床治疗策略提供了一个新的可供探索的途径。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 研究意义

1．2 研究背景

1．3 本文拟开展的研究工作

第二章 Foxo1负性调控NK细胞的发育与成熟

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 天然化合物Phyllanthusmin C通过TLR激活NF-κB增强人NK细胞IFN-γ生成

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

本研究的创新之处

参考文献

文献综述 记忆性NK细胞

攻读学位期间发表的论文

致谢