去乙酰化酶Sirt3对肠上皮屏障功能的作用研究

摘要

背景及目的:
　　肠黏膜屏障是机体防御的重要屏障,多种急慢性病理条件诱发肠粘膜屏障功能(IBF)损伤的共同机制可能是肠粘膜缺氧,各种手术应激、创伤等病理条件都会导致肠道的局部缺氧,进而破坏紧密连接蛋白(TJs),影响该屏障的功能。而在这一过程中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)起着重要作用。去乙酰化酶Sirt3是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖型的组蛋白去乙酰化酶家族的重要成员之一。其在能量代谢、基因沉默、DNA损伤修复、有丝分裂调控及抗凋亡等方面起着重要的作用。而有关缺氧条件下去乙酰化酶Sirt3能否调控缺氧诱导因子,减轻肠屏障功能受损的报道目前尚少。我们采用RNA干扰(RNAi)技术及对肠上皮细胞的缺氧处理,观察Sirt3对缺氧诱导因子-1α及肠屏障功能的影响。紧密连接是构成肠道黏膜机械屏障上皮细胞的重要结构,可防止肠道有害物质侵入肠黏膜组织,维持肠上皮的通透性和细胞的极性。肠粘膜屏障功能调控与肠粘膜局部的缺氧密切相关。
　　目前研究已表明在诸如感染性休克、内毒血症、缺血再灌注、炎症性肠病等多种急慢性病理情况下,都会发生肠粘膜的局部缺氧,这种粘膜缺氧又会与炎症反应协同作用,而大量炎症因子也会加剧缺氧造成的肠粘膜屏障功能损伤造成细菌和(或)内毒素入血引发肠源性感染、全身性炎症反应、MODS等,而缺氧诱导因子是这一过程的重要调节因子,部分HIF-1α缺失可以减轻肠道缺血缺氧造成的损伤。
　　Sirtuins或沉默信息调节蛋白2(Silencing information regulator2, S-ir2)类似酶是一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖型的组蛋白去乙酰化酶的家族,Sirt3属于该家族的成员之一。目前大量研究证明,Sirt3在慢性损伤过程中发挥着重要作用,尤其是Sirt3可以抑制与肿瘤发生相关的瓦博格效应,从而减少肿瘤的突变概率。
　　HIF-1α作为与缺氧状态密切相关的转录调控因子,担负着重要的肠粘膜屏障调节者的角色。为此,在本实验中我们采用RNA干扰技术首先验证Sirt3对HIF-1α是否有调控作用。由于 Sirt3在肠道中相对较少,我们在实验中对其在常氧状态下蛋白和mRNA表达水平进行了检测,从而确保了实验的可行性。在研究中发现Sirt3在常氧与缺氧的不同时段表达并无明显差异。在常氧+Sirt3-siRNA组蛋白几乎没有表达,说明干扰效果较好;在缺氧+Sirt3-siRNA组Sirt3蛋白仍有表达,这可能与干扰效率相关。而HIF-1α在缺氧6h表达最明显,这与我们前期的研究结论一致。同时HIF-1α蛋白表达升高时,mRNA在常氧和低氧条件下变化不明显,这与文献报道的其在食管癌与膀胱癌中的变化相符。由于HIF-1α是一个具有中枢性意义的转录调控因子,可以通过多个通路作用于紧密连接蛋白来执行应激和病理条件下的肠粘膜屏障调节机制,因此我们也对紧密连接蛋白及肠屏障功能的变化进行了研究。
　　研究方法:
　　1.细胞培养:Caco-2细胞在37℃、5％co2、饱和湿度条件下用含20%胎牛血清MEM培养基培养,用0.25%胰酶消化传代。
　　2.细胞转染:细胞接种至六孔板后,当细胞密度达到30%-50%时,各取5μl/孔Lipofectamine2000、Sirt3-siRNA用250μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释,室温孵育5min;将两者混合室温静置20min,然后加入含细胞的孔中,放入37℃培养箱中培养6h后将培养基换为含血清的完全培养基。3.细胞分组及处理:待细胞培养96h后,将细胞的培养基更换为1ml不含胎牛血清的MEM培养液,分别行常氧处理(正常对照组Nx、常氧+Sirt3-siRNA组)、缺氧6h处理(1%O2 Hx组,缺氧6h+Sirt3-siRNA组)。将细胞置于37℃培养箱中,不间断通入含有体积分数为:1%O2,5%co2的混合气体培养6h。
　　4.RNA的提取及RT-PCR:细胞缺氧6h后,使用冷盐酸缓冲液(PBS)漂洗3次,每孔中加入Trizol,按照Trizol说明书提取总RNA。总RNA定量后取1μg按照PrimeScript逆转录试剂盒进行逆转录,体系为20μl,合成 CDNA。RT-PCR扩增条件:955min,9445s,58℃30s,72℃45s,共30个循环,最后72℃延伸10min。取8μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(110v,35min),采用Kodak Molecular Imaging软件分析相对定量。
　　5.蛋白提取与Western blot检测:使用PBS将缺氧6h后的细胞漂洗3次,每孔中加入预冷混有10μl的苯甲基磺酰氟(PMSF)的 RIPA裂解液100μl,冰上放置30min,12000xg4℃离心15min。使用蛋白测定试剂盒测定上清液蛋白含量。蛋白上样后70V电泳,蛋白跑过上层胶后,改为100V电泳1.5h;200v恒流湿转2h至PVDF膜,转膜后使用50g/l的脱脂奶粉封闭2h,加入 Sirt3、Occludin、Claudin-1、Zo-1、HIF-1α、GAPDH一抗后4℃冰箱过夜。TBST洗膜3次,每次10min。将化学发光试剂均匀滴加在目的蛋白上,使用图像分析系统采集发光信号后,再通过 Kodak Molecular Imaging软件进行密度分析,将其与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的灰度比值当作目的蛋白的表达量。
　　6.肠上皮细胞跨上皮电阻(TER)测定:Caco-2细胞以2×105个/孔接种于Transwell小室微孔膜上培养,每日定时更换培养基,测定细胞 TER,当测定的值达到稳定后(4d),进行实验处理。处理分为4组(具体分组同上),每个处理组取3个孔,重复实验3次。TER值按照原始数值减去空白对照数值(Rcell monolayer=Rsample-Rblank)表示,结果表示为处理后的值占处理前的百分比。
　　7.统计学方法:应用 SPSS13.0统计软件分析,结果均以均数±标准差(`x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。
　　研究结果:
　　1、Sirt3与HIF-1α蛋白表达变化。Western blot分析Sirt3和HIF-1α不同处理组的变化:Nx+Sirt3-siRNA组Sirt3蛋白表达较Nx组下降52%; Hx+Sirt3-siRNA组Sirt3蛋白表达较Hx组下降35%。Nx+Sirt3-siRNA组HIF-1α蛋白表达升高(0.72±0.01),较Nx组上升约89.5%,差异有统计学意义(p<0.01); Hx+Sirt3-siRNA组 HIF-1α蛋白表达升高(0.93±0.01),较Hx组升高约14.8%,差异有统计学意义(p<0.01)。。
　　2、肠上皮细胞TJs的蛋白水平的变化:采用Western blot法,检测2%O2 Hx组和缺氧6h+Sirt3-siRNA组蛋白的变化,分别与常氧组及常氧+Sirt3-siRNA组进行比较, TJs选用 ZO-1、Occludin、Claudin-1,此3种分子在缺氧+Sirt3-siRNA组的蛋白水平(0.72±0.02、0.71±0.03、0.69±0.01)较Hx组下降22%、20%、12%差异有统计学意义(p<0.01)而常氧+Sirt3-siRNA组TJs的蛋白水平与Nx组蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05)。
　　3、肠上皮细胞 TJs的 mRNA水平的变化:采用 RT-PCR法,检测2%O2 Hx组和缺氧6h+Sirt3-siRNA组mRNA的变化,分别与常氧组进行比较。ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA在缺氧+Sirt3-siRNA组的水平(0.88±0.03、0.80±0.01、0.84±0.01)较 Hx组下降约22%、40%、28%差异有统计学意义(p<0.01)。较Nx组下降42%、62%、32%,差异有统计学意义(p<0.01)。而常氧+Sirt3-siRNA组TJs的mRNA水平与Nx组表达差异无统计学意义(p>0.05)。
　　4、肠上皮电阻的变化:Nx+Sirt3-siRNA组 TER值与 Nx组差异无统计学意义(p>0.05),而 Hx+Sirt3-siRNA组TER下降明显(36.17±3.81)%较Hx组(52.26±2.68)%下降30.8%,与常氧对照组(102.58±2.31)%比较下降64.7%,差异有统计学意义(p<0.01),证明沉默 Sirt3,可使肠上皮TER降低,造成肠上皮通透性不稳定。
　　结论:
　　1. SIRT3调节HIF1α稳定。常氧与缺氧条件下Sirt3的表达变化无明显差异,而在缺氧条件下HIF-1α表达比常氧条件下明显升高,其中缺氧六小时表达最高。在缺氧条件下(6H)沉默Sirt3,发现HIF-1α的表达升高,说明Sirt3对HIF-1α有调控作用。
　　2.沉默紧密连接蛋白的表达下降。缺氧条件下经过SIRT3-siRNA转染后紧密连接蛋白的mRNA蛋白表达比转染前明显降低。而在常氧和常氧转染组则没有明显变化。
　　3.SIRT3通过调控HIF1α的稳定性,影响肠粘膜屏障功能。

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第一章 前言

第二章 缺氧条件下Sirt3及HIF-1α的表达变化

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器仪器名称

2.1.3 主要配置试剂

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2传代培养

2.2.3 细胞转染

2.2.4细胞分组处理

2.2.5 PCR反应分析

2.2.6 Western Blot检测

2.3 结果

2.3.1缺氧条件下HIF-1α的表达变化

2.3.2不同条件下沉默sirt3后HIF-1α的表达变化

2.4 讨论

第三章 缺氧条件下Sirt3对肠上皮屏障功能的作用

3.1 材料与方法

3.1.1实验材料

3.2 结果

3.2.1肠上皮细胞株Caco-2的TER变化

3.2.2肠上皮细胞株Caco-2TJs的mRNA水平的变化

3.2.3肠上皮细胞株Caco-2TJs的蛋白水平的变化

3.3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

硕士研究生期间撰写和发表的文章

致谢