错误折叠的超氧化物歧化酶-1导致淀粉样蛋白β聚积增加

摘要

淀粉样斑块是阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理特征之一，这种斑块的主要成分是淀粉样蛋白β(amyloidβ，Aβ)。研究已证明，Aβ蛋白寡聚体有多种毒性，可破坏神经突触，被认为是AD的重要发病机制。一些家族遗传型的AD患者脑组织内Aβ较多，也说明Aβ与AD的密切关系。Aβ可自发聚积，Aβ淀粉样斑块的分子构象已较为明确，即多个蛋白单体中的β折叠整齐地如积木搬堆叠在一起，形成一个长轴与β折叠垂直的条带，这个条带被称为Aβ蛋白原纤维。多条蛋白原纤维再相互缠绕堆积，最终导致淀粉样斑块的生成。蛋白原纤维形成需要一个相对耗时的“成核”阶段，即最初的几个Aβ聚积成一个稳定的原纤维核的过程。一旦“成核”完成，Aβ就可以较为快速的添加到已有的蛋白原纤维上。显然更多的核会让Aβ的聚积更容易。
　　另一方面，老化是AD最重要的危险因素，但机制不明确。现在普遍认为体内和体外环境中大量存在的活性氧簇攻击细胞后留下的损伤积累起来导致了老化现象，过氧化物歧化酶-1(Superoxide dismutase-1，SOD1)的正常功能是歧化过氧化物，减少活性氧簇的攻击，但其本身作为一种需要与大量活性氧簇接触的蛋白质很容易被氧化。氧化型和突变型SOD1仍然具有歧化过氧化物的功能，但很容易错误折叠，并形成聚积，这种聚积有着与Aβ聚积相似的β折叠堆叠结构。已有研究显示，Aβ蛋白与SOD1可堆积在一起并产生蛋白间相互作用。
　　基于上述研究发现，我们推测，SOD1可能是Aβ与老化之间关系的关键分子，即:因氧化修饰或基因突变而形成错误折叠的SOD1，获得特殊的性质而使Aβ寡聚物和纤维增多，从而使Aβ增加和老年斑形成。我们假设这种特殊的性质可能是因为是SOD1错误折叠形成的聚积和Aβ蛋白有着相似的β折叠结构，所以Aβ蛋白可以叠加在SOD1核上，形成以SOD1为核的Aβ原纤维，使得Aβ的聚积增加。
　　材料与方法：
　　1.实验动物和基因型检测
　　本实验中使用了同时具有SOD1/G37R突变和APP瑞典突变的双重转基因小鼠。这种小鼠是通过两种具有单一突变的转基因小鼠杂交而来。双转小鼠的筛选主要包括DNA提取、PCR和凝胶电泳三个步骤。
　　2.小鼠脑标本收集及切片制备:当幼鼠达到预定月龄时即被处死并进行标本收集和制备，小鼠的左脑用于制备切片进行形态学研究而右脑则用于蛋白定量实验。
　　3.脑片的刚果红(Congo red)染色:本实验中的刚果红染色使用了Sigma-Aldrich公司生产的刚果红染色试剂盒。
　　4.N2a/APPsw细胞的复苏和培养
　　5.重组质粒的转化、扩增和提取:pcDNA3.1-G37R链接产物由陈雪萍(Departmentof Human Anatomy and Cell Science University of Manitoba, Winnipeg, Canada)提供。重组质粒转化步骤按Invitrogen公司MAX Efficiency DH5α Competent Cells试剂盒使用说明书进行。
　　6.质粒转染:为了研究突变型SOD1对于Aβ蛋白聚积的影响，我们用G37R突变的SOD1基因转染了N2a/APPsw细胞。本研究中使用了Lipofectamin2000(Invitrogen)脂质体转染。
　　7.Aβ和SOD1双重免疫荧光染色
　　8.脑皮质Aβ42/40蛋白酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)
　　9.统计分析:
　　ELISA结果中的浓度值以平均值±标准差表示，应用SPSS20.0软件进行数据分析。各时间点组内结果方差齐性检验，然后进行方差分析。小鼠大脑淀粉样斑块负荷(Amyloid burden)为淀粉样斑块面积占视野中整个大脑面积百分比，淀粉样斑块数量以及淀粉样斑块负荷结果以平均值±标准差表示，方差齐性检验后进行方差分析。小鼠脑片免疫荧光染色结果中的细胞内淀粉样斑块负荷(intracellular amyloid plaqueburden)为视野下胞质中呈斑块样的信号面积占视野下整体细胞面积的百分比，平均荧光强度为细胞质荧光密度与细胞质面积的比值，结果以平均值±标准差表示，方差齐性检验后进行方差分析。P值＜0.05视为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.双转小鼠脑皮质中可溶性及不可溶性Aβ42/40含量上升
　　实验结果提示双转小鼠脑中Aβ42和Aβ40的增长呈现类似的特征。对于可溶性Aβ42和Aβ40，9月龄和12月龄年龄组小鼠存在具有统计学意义的组内差异，双转小鼠脑皮质中的可溶性Aβ42和Aβ40显著高于单转小鼠组，说明突变的SOD1使这两个月龄组小鼠脑皮质中的可溶性Aβ42和Aβ40增加。3月龄和6月龄组中并未检测出两种基因型小鼠间有Aβ42和Aβ40的明显差异。说明可溶性的Aβ42和Aβ40的主要增长时间在6月龄之后。
　　对于小可溶性Aβ42和Aβ40，6月、9月及12月龄组均存在具有统计学意义的组内差异，说明突变的SOD1使小鼠脑皮质中的不可溶性Aβ42和Aβ40含量均有增加。并且相对于可溶性的Aβ42和Aβ40，不可溶性Aβ42和Aβ40受突变SOD1影响的时间更早，从6月龄开始就有了显著的差异。
　　2.双转小鼠脑中淀粉样斑块生成没有明显增多和提前
　　染色结果显示两组小鼠淀粉样斑块的数量以及大小之间的差异并不明显。在12月龄时两组小鼠脑中或只发现了微小的散在的斑块或者完全没有斑块形成，在8月龄双转小鼠脑中也并未发现任何淀粉样斑块。统计结果显示两组小鼠大脑淀粉样斑块负荷(Amyloid burden)以及斑块数量没有差别。该结果提示双转小鼠脑中的淀粉样斑块生成并没有明显的增多或者提前。
　　3.APP+/G37R+12月龄双转小鼠神经元中Aβ蛋白聚积增加
　　结果显示APP+/G37R+12月龄小鼠神经元中Aβ蛋白信号强度明显强于单转小鼠脑中的Aβ信号强度。且双转小鼠中神经元中Aβ蛋白除一部分在细胞质中聚积成斑块状，还有一部分蛋白在细胞质中弥散分布。细胞内淀粉样斑块负荷(intracellular amyloidplaque burden)统计提示双转小鼠细胞内聚积成斑块状的Aβ占整个细胞面积的百分比约为单转小鼠该比值的8倍。而双转小鼠细胞质的平均荧光强度值也强于单转小鼠，说明细胞质中可溶性的Aβ蛋白也增加了。该结果提示在双转小鼠模型中，突变的SOD1使Aβ的表达增加，并且Aβ的聚积也有所增加。这个结果与Aβ的ELISA结果相符，弥散和聚积的Aβ蛋白分别对应不可溶和可溶性的Aβ。并且聚积的Aβ与聚积的SOD1在细胞中共定位，提示了这两者间紧密的联系。
　　4.Aβ蛋白在N2a/APPsw/G37R细胞中表达和聚积增加
　　成功转染了SOD1基因的细胞因为表达人类突变的SOD1而被SOD1探针识别，发出绿色荧光。突变的SOD1在细胞质中弥散分布，也有小部分聚积成颗粒状，但并不明显，可是能由于染色时间仅为转染后48小时，突变的SOD1还未形成较大体积的聚积。成功转染SOD1基因的N2a细胞中的Aβ蛋白信号强于未成功转染的细胞，并且一部分蛋白聚积成了较大的颗粒。此实验结果与ELISA和小鼠脑皮质冰冻切片的双重免疫荧光标记结果相符，都说明突变的SOD1蛋白能够使细胞表达更多的Aβ蛋白并且Aβ蛋白的聚积也会增加。另外，该实验结果说明突变的SOD1蛋白在还没有形成较大的聚积时就可以增加Aβ蛋白的表达与聚积。与脑皮质标本不同的是SOD1蛋白和Aβ蛋白在N2a/APPsw/G37R细胞中并未形成明显的共定位，可能与较短的转染后时间有关。
　　讨论和结论：
　　本试验研究了Aβ聚积的具体形式以及错误折叠的SOD1在体内以及体外实验中对Aβ聚积的影响。我们用ELISA的方法观察了转基因小鼠脑皮质中可溶性和不可溶性的Aβ蛋白水平。实验结果证明了错误折叠的SOD1增加了Aβ蛋白的聚积，双转小鼠脑中可溶性与不可溶性的Aβ含量均上升，与我们的预期结果并不完全相符。我们的猜想是错误折叠的SOD1通过成为额外的“核”来增加Aβ的聚积，而不是增加Aβ的整体含量。这说明Aβ的整体表达量在双转小鼠中增加，错误折叠的SOD1可能是通过别的方式影响了Aβ的聚积，比如SOD1错误折叠后获得的毒性作用。另外，实验结果中提示双转动物脑中不可溶性Aβ的升高的时间早于可溶性Aβ的升高的时间，也提示了负反馈调节存在的可能性。Bradley J.Turner等人之前的研究结果显示APP蛋白和Aβ蛋白在G93A转基因小鼠皮质中的含量较野生型小鼠没有明显增加，这与本实验中的结论相悖。
　　刚果红对小鼠脑片进行染色显示，双转和单转小鼠脑中淀粉样斑块的情况并没有明显的差异，都仅有少量或没有斑块，这与预期的实验结果也不符。我们分析可能是因为G37R突变相对来说是一种较为温和的突变，所以对于APP+/G37R+小鼠来说，12月龄可能仍然是淀粉样斑块刚开始形成的时期，这导致了这一时期双单转小鼠之间的差异尚不明显。
　　双重免疫荧光染色来观察细胞内SOD1与Aβ的情况，实验结果与预期相符，双转小鼠神经元中的Aβ整体含量以及Aβ聚积形成的斑块的数量和面积都明显高于单转小鼠。而细胞质中弥散的Aβ含量也在双转小鼠中升高了。在细胞中弥散和聚积分布的Aβ分别对应了可溶性Aβ42和不可溶性Aβ42的ELISA结果。双转小鼠细胞中这两类的Aβ信号都得到了增强，这个结果与ELISA的结果相一致。结合我们的实验结果以及其他实验小组对于Aβ在细胞内和细胞外聚积的观察，我们推测Aβ增高后首先会在细胞内聚积，聚积的程度可能需要达到某一个阈值才会开始由细胞内运输到细胞外。
　　我们利用与动物模型相对应的细胞模型并且观测到了相似的结果。值得指出的是在N2a细胞中的的SOD1并没有像在动物神经元中那样聚积成斑块并且和Aβ斑块共定位，这提示误折叠的SOD1不需要聚积成较大的“核”就可以增加Aβ的表达和聚积，再一次提示除了“成核”之外，错误折叠的Aβ可能还通过其他方式使Aβ表达上升。
　　综上所述，本研究结果显示，错误折叠的SOD1在体外、细胞、和实验动物水平都使Aβ的聚积增多，提示SOD1的错误折叠可能是Aβ聚积和AD起病的初始原因。