依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞胀亡及其分子机制的研究

摘要

研究背景:
　　依布硒(Ebselen2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one)是一种具有抗肿瘤活性的含硒有机化合物,目前其抗肿瘤作用针对不同类型肿瘤是否具有选择性鲜见报道,其诱导肿瘤细胞死亡的病理类型尚存争议,所涉及分子机制也不清楚。前期预实验通过CCK8法检测Ebselen对不同种类肿瘤细胞株细胞活力的影响发现血液来源肿瘤多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM)细胞株U266和RPMI8226对Ebselen的抗肿瘤活性较其他实体肿瘤细胞株更加敏感。MM是一种B细胞来源的恶性浆细胞肿瘤,目前临床治疗疗效差,预后不良,在我国发病率将逐年增高,因此针对MM的新药研发具有重要意义。
　　研究目的:
　　本研究的主要目的是确定依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞死亡的病理类型,并尝试探讨其中的分子机制,为依布硒应用于多发性骨髓瘤治疗提供部分基础理论依据。
　　研究方法:
　　1.为了确定依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞死亡的病理类型,我们首先通过光学显微镜和透射电镜观察依布硒处理后细胞形态和超微结构的变化,然后利用台盼蓝染色和Annexin V–propidium iodide(AV–PI)双染检测细胞通透性的改变,最后利用Hoechst染色及彗星实验检测依布硒对细胞核及DNA的影响。
　　2.为了进一步探讨依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞死亡的分子机制,我们利用荧光探针检测了细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species ROS)的含量和细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential MMP)的变化。
　　3.通过 Western-blot实验检测依布硒对细胞内 Bax、Bcl-2、细胞色素 C、cleaved-Caspase9等凋亡相关蛋白的影响,通过 Real-time PCR及 Western-blot检测Thioredoxin1(Trx1)基因转录水平和蛋白表达量的变化,而后又通过 EMSA实验检测依布硒对细胞内转录因子HIF-1α和NF-kb转录活性的影响。
　　4.最后应用不同类型抗氧化剂预处理多发性骨髓瘤细胞后检测抗氧化剂对依布硒上述作用的影响。
　　研究结果:
　　1.依布硒作用于多发性骨髓瘤细胞后,细胞膜出现圆形泡状突起并逐渐增大,胞浆高度空泡化,多种细胞器明显肿胀呈气球样;台盼蓝染色和PI染色均阳性提示细胞膜屏障作用消失,通透性增加,胞核染色质凝聚、碎裂,DNA链断裂。
　　2.经依布硒处理后多发性骨髓瘤细胞内 ROS水平升高,线粒体膜电位丢失;对凋亡相关蛋白检测结果发现细胞内Bax蛋白减少且从胞浆向线粒体转位,细胞色素C从线粒体释放至胞浆,Caspase9蛋白未被激活;Trx1在基因转录和蛋白表达水平上都明显下降;HIF-1α和NF-kb的转录活性也明显降低。
　　3.通过实验我们还发现应用不同种类抗氧化剂预处理细胞能够拮抗或部分拮抗依布硒的上述作用。
　　结论:
　　1、依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞死亡的病理类型是胀亡。
　　2、ROS在依布硒能诱导细胞胀亡的分子机制中发挥重要作用,依布硒可能通过提高 ROS水平激活 Bax蛋白,增加线粒体膜的通透性,损伤线粒体功能最终诱导细胞死亡。
　　3、依布硒促ROS作用可能与其破坏细胞自身氧化还原调节体系密切相关,特别是硫氧还蛋白体系中富含巯基的硫氧还蛋白可能是依布硒抗肿瘤作用的靶蛋白。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章：依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞发生胀亡

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 结论

第三章：依布硒诱导多发性骨髓瘤细胞发生胀亡的分子机制

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 结论

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢