STAT3磷酸化抑制人单核细胞来源的树突状细胞成熟机制的初步研究

摘要

背景及目的:
　　胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,其死亡率高,预后差,严重危害人类的健康。逃避机体的免疫监视是胃癌发生、发展和转移的一个重要机制。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)作为机体最主要的抗原递呈细胞,调节机体的免疫平衡及免疫反应,是免疫监视中最关键的细胞。研究表明:DCs的分化成熟障碍及功能缺陷与胃癌的免疫逃逸有密切的关系。DCs从骨髓造血干细胞到未成熟DCs(immature DCs,imDCs),再到免疫刺激功能完善的成熟DCs(mature DCs,mDCs)需要经过一系列的分化过程,癌细胞通过干扰DCs分化的多个环节,使得肿瘤患者体内DCs数量下降,成熟受限,抗原提呈及免疫刺激功能发生障碍,从而消弱或抑制机体对肿瘤的免疫监控。目前已证实胃癌等肿瘤来源的细胞因子如IL-6、IL-10、VEGF、TGF-β等均能使DC分化和成熟发生障碍,其中以IL-6、IL-10作用最为显著,然而具体的分子机制尚不完全清楚。JAK2/STAT3信号通路是IL-6、IL-10的共同信号通路,是信号转导和转录激活的经典途径。近来研究显示,若给予JAK2特异性抑制剂,可以逆转IL-6介导的DCs成熟障碍,此外前期我们预实验研究发现鼠来源的DCs成熟障碍模型中STAT3磷酸化水平明显上调,由此推测该细胞信号途径中STAT3的过度磷酸化可能在DCs分化成熟过程中发挥抑制作用。本课题首先检测人外周血单核细胞建立的两种细胞模型mDCs和imDCs的磷酸化STAT3蛋白的表达水平及其与分化成熟的关系;然后应用分子生物学技术构建STAT3过表达及其干扰序列的重组腺病毒,利用两种腺病毒调控STAT3蛋白的表达来进一步验证上述推测,为后续DCs的分化成熟障与胃癌的免疫逃逸的关系研究奠定基础。
　　方法:
　　1.应用分子生物学技术分别构建STAT3的重组腺病毒及其干扰序列的重组腺病毒,首先PCR扩增获得hSTAT3完整阅读框,而后构建、包装、扩增STAT3的重组腺病毒。利用pSOS-HUS载体从设计合成的4对siRNA筛选最佳STAT3i,进一步构建该干扰序列的重组腺病毒,并包转扩增该重组腺病毒。两种病毒分别命名为AdV-STAT3和AdV-STAT3i。
　　2.利用人外周血单核细胞建立LPS诱导成熟DCs模型(mDCs)和正常诱导未成熟DCs模型(imDCs),通过流式细胞仪检测两组DCs表面分子阳性表达率及应用Westernblot检测细胞模型的STAT3磷酸化情况。
　　3.用构建好的重组腺病毒AdV-STAT3和AdV-STAT3i调控细胞模型,同时利用空病毒AdV-GFP感染imDCs作为对照。通过流式细胞仪检测各组DCs的表面分子阳性细胞率及Westernblot检测细胞模型总STAT3及磷酸化STAT3蛋白表达情况。
　　结果:
　　1.获得了人STAT3的基因序列并成功构建重组AdV-STAT3腺病毒,将筛选到的最佳STAT3i4也成功构建成了重组腺病毒AdV-STAT3i4,扩增后均获得高滴度的病毒。
　　2.流式检测显示常规诱导的imDCs组,其细胞表型分子CD86、CD83、HLA-DR阳性细胞率均明显低于mDCs组(P<0.01),而Westernblot检测其磷酸化STAT3蛋白水平明显高于mDCs组,由此可见磷酸化STAT3蛋白从未成熟DCs到成熟的DCs是由高表达到低表达。
　　3.对于磷酸化STAT3蛋白和DCs的表面分子CD86、CD83、HAL-DR阳性细胞率:AdV-STAT3i4腺病毒组与AdV-STAT3组及AdV-GFP组比均有显著性差异(P<0.01);LPS诱导成熟组与AdV-STAT3组及AdV-GFP组比均有显著性差异(P<0.01);重组AdV-STAT3与AdV-GFP组比(P>0.05),无显著性差异;AdV-STAT3i4与LPS诱导成熟组比较(P>0.05),无显著性差异。而各组DCs总STAT3蛋白同其三种表面分子阳性细胞率没有这样的对应结果。
　　结论:
　　1.成功构建了重组腺病毒AdV-STAT3和AdV-STAT3i4且两种病毒分别能明显增加和降低细胞模型的STAT3表达,提示获得了高效调控STAT3蛋白的手段。
　　2.在人外周血单核细胞构建的LPS诱导DCs成熟模型中检测到磷酸化STAT3低表达,而未成熟模型中检测到磷酸化STAT3高表达,提示STAT3磷酸化水平与DCs的分化成熟有关。
　　3.利用构建好的AdV-STAT3和AdV-STAT3i4调控细胞模型后显示,DCs的分化成熟情况与磷酸化STAT3的表达变化呈负相关,与总的STAT3无关,进一步验证了STAT3过度磷酸化在DCs分化成熟中发挥抑制作用的推测,为后续DCs的分化成熟障碍与胃癌的免疫逃逸的关系研究奠定基础。

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第一章 前 言

第二章 人STAT3重组腺病毒的构建及其干扰序列重组

2.1 材料方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

2.4 小 结

第三章 STAT3磷酸化对人外周血单核细胞来源的树突状

3.1 材料与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

3.4 小 结

参考文献

致谢