甲型副伤寒沙门菌减毒活疫苗的构建及其效能研究

摘要

甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiA，SPA)是甲型副伤寒(paratyphoid feverA)的病原菌，主要通过粪—口途径传播，感染剂量约为103～109CFU/人，能够引起类似伤寒样的临床症状。人群对甲型副伤寒沙门菌普遍易感，但以儿童和青壮年发病率最高。近年来，由甲型副伤寒沙门菌引起的肠热症发病率在全球很多地区呈上升趋势，已经成为一个重大公共卫生问题。在我国，甲型副伤寒的发病率较世界其他国家和地区更高，并在局部地区时有暴发流行。早期使用的伤寒多价灭活疫苗虽然对甲型副伤寒有预防作用，但因副反应大而不再使用，市场上尚无新的有效预防甲型副伤寒的疫苗。鉴于甲型副伤寒疫苗的公共卫生需求越来越大，目前有必要尽快开展新的疫苗研发工作。
　　疫苗主要包括组分疫苗（灭活疫苗类似于组分疫苗）和减毒活疫苗两大类。组分疫苗由病原体的主要保护性抗原制备而成，包括蛋白类和多糖类抗原。易感人群通过接种一定量的抗原诱导机体产生针对该种抗原的抗体，从而对表达相关抗原的病原产生免疫防护，如伤寒沙门菌的Vi多糖疫苗，百白破三联疫苗等;减毒活疫苗则是通过对病原菌进行遗传改造，使其在毒力大幅度降低、安全性有保障的基础上保留良好免疫原性，如Ty21a减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗和甲型肝炎减毒活疫苗等。理想的减毒活疫苗是安全性与免疫原性的最佳平衡状态。两类疫苗均能诱导机体产生较强的系统免疫，从而及时清除入侵机体的病原。减毒活疫苗还能诱导机体产生局部免疫，能够有效阻止病原菌在局部的定植、增殖和感染，减少隐性感染的发生几率，对疾病的传播有更好的阻断作用。甲型副伤寒通常被归类为“旅行相关性疾病”，其感染后可以形成带菌状态，增加了旅行者传播的危险。因此，甲型副伤寒减毒活疫苗的构建和应用更有利于机体对甲型副伤寒沙门菌感染的防护，从而控制疾病的流行。
　　我们拟通过敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的yncD基因和aroC基因构建一个减毒疫苗株。yncD基因为本实验室前期筛选到的一个伤寒沙门菌体内诱导基因，研究发现，yncD基因敲除后，伤寒沙门菌毒力显著减弱，且敲除株具有良好的免疫保护效果。在已测序的沙门菌4种主要血清型基因组中，yncD基因序列相似度在98％以上，提示yncD基因的功能在沙门菌中高度保守。aroC基因是沙门菌合成芳香族氨基酸的调控基因，敲除后会导致相应氨基酸无法合成，因此导致细菌在机体中的生长繁殖受到限制，进而导致毒力的减弱。aroC基因也是一个构建减毒株常用的靶基因。
　　本研究中我们成功构建了一个△yncD/△aroC双基因敲除的甲型副伤寒沙门菌减毒疫苗株。在评价其减毒效果的基础上，对疫苗株的遗传稳定性、疫苗的免疫原性和安全性进行了初步评价，主要研究内容和结果如下:
　　1.甲型副伤寒沙门菌野生株的鉴定和表型分析:
　　甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株购自中国药品生物制品检定所菌种保存中心，在本研究中作为野生株。为进一步了解野生株的生物学性状，我们首先以CTAB法提取其基因组DNA，扩增16SrRNA基因并进行核酸测序分析，鉴定野生株。同时将培养菌株送我校某附属医院检验科进行生化鉴定及耐药谱分析。结果显示，该株菌为甲型副伤寒沙门菌，生物学性状典型，对常用的针对革兰阴性菌的抗生素敏感，适合用于构建减毒活疫苗。
　　2.甲型副伤寒沙门菌△yncD/△aroC双敲除株的构建:
　　双基因敲除株构建采用同源重组法进行。选用的载体为一个适用于革兰阴性菌的自杀性敲除载体pYG4，该载体包含一个来源于R6K质粒的π蛋白依赖性复制起点oriR6K，使质粒只能在表达π蛋白的菌株中复制，如E.coil S17-1/λ pir细菌，在其它细菌（包括沙门菌）体内则是自杀性的。pYG4质粒的正向选择标记为卡那霉素，反向选择标记为sacB基因，后者为来自于枯草芽胞杆菌的果聚糖蔗糖转移酶基因，表达该蛋白的革兰阴性菌在含有蔗糖的培养基中生长时，会将蔗糖分解为对细菌有毒的产物，从而杀死表达该蛋白的细菌，因此可以用于反向选择。由于采用的是无痕敲除方式，即敲除目的基因后，突变株基因组中不会引入任何核酸片段，因此针对同一菌株可以反复操作，以实现多基因的敲除。在本课题研究中，我们两次采用该自杀载体对甲型副伤寒沙门菌进行目的基因的精确敲除。
　　我们成功获得了甲型副伤寒沙门菌的△yncD单基因及△yncD/△aroC双基因敲除株，核苷酸测序分析表明，在敲除的靶基因处没有任何外源片段（包括抗性片段）插入。
　　3.甲型副伤寒沙门菌△yncD/△aroC双敲除株的生长曲线和LD50测定
　　采用三线法将野生株、△yncD单敲除株和△yncD/△aroC双敲除株接种到同一块普通的LB平板，观察△yncD/△aroC双敲除株菌落生长状况;用普通的LB液体培养基测定其生长曲线，利用BALB/c小鼠腹腔胃黏蛋白增毒模型检测△yncD/△aroC双敲除株的毒力变有无化。菌落生长状况和生长曲线结果均显示，双敲除株的生长状况有了明显改变，主要表现在生长速率和最大菌液浓度都较野生株有了显著的降低;毒力实验中野生株和双敲除株分别以2.5×101，2.5×102，2.5×103，2.5×104，2.5×105，2.5×106和2.5×107CFU/只等7个接种剂量经腹腔感染小鼠，3天后计数小鼠的存活情况，并用SPSS软件的probit回归分析分别计算野生株和双敲除株的半数致死量(LD50)。结果显示双敲除株的毒力仅为野生株的约1/42000，表明双敲除株的毒力较野生株有了显著下降。
　　4.甲型副伤寒沙门菌△yncD/△aroC双敲除株安全性的初步评价
　　利用细胞实验检测△yncD/△aroC双敲除株对单核巨噬细胞的侵入和胞内生存能力，用小鼠腹腔感染模型检测感染小鼠的带菌情况。双敲除株、△yncD单敲除株和野生株细菌分别以5×106 CFU/孔感染经PMA诱导后的人单核巨噬细胞THP1，12小时后裂解细胞释放出细菌，并用普通LB平板培养后对菌落进行计数。结果显示，双敲除株的菌落数量无论是最初的侵入数量还是在胞内培养后的数量都较野生株有显著地降低，同时还发现，双敲除株的菌落数量随着胞内培养时间的延长而显著减少，而野生株正好相反。双敲除株和野生株细菌分别以2.5×103，2.5×104，2.5×105 CFU/只的接种剂量经腹腔注射感染小鼠，接种后第7天处死小鼠，无菌取出肝、脾脏器，以PBS洗涤后匀浆，匀浆液梯度稀释后涂布LB平板，对生长的菌落计数。结果显示，双敲除株在感染动物体内的生存能力也有了显著性的降低，具体表现在野生株在2.5×104和2.5×105 CFU剂量下，野生株攻击组小鼠的脏器中有细菌存在，而双敲除株攻击组则在三个浓度均没有细菌菌落生长。以上实验初步显示，双敲除株的侵入能力和胞内生存能力都有了显著降低，安全性较好。
　　5.甲型副伤寒沙门菌△yncD/△aroC双敲除株的免疫方式和免疫原性评价
　　分别采用鼻黏膜接种、腹腔接种和灌胃接种三种方式对小鼠进行免疫，以测定不同的接种方式对双敲除株免疫原性的影响;利用ELISA方法检测免疫小鼠血清抗-LPS抗体滴度初步评价双敲除株的免疫原性。结果显示，灌胃接种组未引起小鼠的免疫反应，而鼻黏膜高浓度(2.0×109CFU/只)接种组和两个腹腔接种组均能够引起小鼠较好的免疫反应。以提纯的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌LPS分别包被96孔板对小鼠血清中的抗-LPS抗体滴度进行检测，结果显示，免疫接种后小鼠血清中的抗体滴度明显高于未接种小鼠，并且两种LPS的抗体滴度相差不大。沙门菌LPS被认为是沙门菌主要保护性抗原之一，实验结果表明，双敲除株具有良好的免疫原性。
　　6.甲型副伤寒沙门菌△yncD/△aroC双敲除株的免疫保护性评价
　　免疫小鼠血清中针对伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的LPS的抗体滴度接近，表明小鼠可能存在针对伤寒沙门菌的交叉免疫。采用甲型副伤寒沙门菌野生株和伤寒沙门菌Ty2菌株分别对免疫接种后的小鼠进行毒力攻击，以检测双敲除株的免疫保护作用和交叉免疫保护效果。我们采用鼻黏膜高浓度(2.0×109 CFU/只)接种对小鼠进行免疫，同时设置PBS对照。野生株和Ty2株攻击均采用2.5×101，2.5×102，2.5×103，2.5×104，2.5×105，2.5×106CFU/只6个剂量。结果显示，免疫后的小鼠和对照小鼠相比较，对甲型副伤寒沙门菌有很好的免疫防护作用，而针对Ty2却只在低剂量(2.5×101CFU)时才和对照组显示出明显的差异，其是否能起到交叉保护效果尚待进一步实验论证。采用ELISA方法检测免疫小鼠在受到毒株攻击时，血清中IL-6、IL-12和TNF-a等炎症因子的变化。野生株致死剂量对免疫小鼠和对照小鼠进行腹腔接种，接种后的20小时内每4小时取血一次，并检测血清中的炎症因子。结果显示，免疫组和对照组的炎症因子都有上升，但免疫小鼠上升幅度显著低于对照小鼠，同时消退时间缩短，表明双敲除株的免疫能增强细菌的清除，进而减低宿主的炎症反应，具有良好的保护作用。

目录

声明

英文缩写

摘要

第一章 前言

第二章 甲型副伤寒沙门菌△yncD／△aroC双敲除株的构建

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 甲型副伤寒沙门菌△yncD／△aroC双敲除株的初步效能研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文小结

参考文献

文献综述 甲型副伤寒及其病原体研究进展

攻读学位期间的研究成果及参与的课题

致谢