微重力生物反应器内球形体培养对脂肪源性干细胞干性的影响

摘要

背景:间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的干性特征(stemnessproperties)包括自我更新能力和多向分化潜能，是其应用于组织工程和再生医学的重要基础。脂肪源性干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是一种组织来源丰富的MSCs，可从临床脂肪抽吸术获得的大量皮下脂肪组织中提取。无论是骨髓还是脂肪组织，MSCs占组织细胞中比例极小，必须经过大量扩增培养才能够获得治疗应用需要的足够数量细胞。但在传统的单层细胞培养过程中，MSCs随着扩增传代次数的增加或培养时间延长，逐渐失去干性特征。因此，探索维持MSCs干性的体外培养方法是MSCs进一步临床应用研究急需解决的关键问题之一。
　　MSCs在体内能够长久地维持自我更新与多向分化潜能的干性特征。越来越多的研究表明，细胞微环境在决定细胞的干性特征中发挥重要作用。三维细胞培养较传统细胞培养方法提供的细胞微环境更相似于体内微环境。多种三维细胞培养模式，如多孔支架材料或高分子材料聚合物支架材料、凝胶、细胞聚集体等已被应用于多种干细胞的干性维持。其中球形培养技术是利用细胞自我聚集形成细胞球的特性而建立的一种无支架材料的三维细胞培养方法。以往研究发现采用悬滴法和低粘附材料法进行球形体培养能有效维持MSCs的干性特征，但不适合大规模培养。微重力生物反应器是可用于细胞大规模培养和球形体制备的有效方法，但迄今为止尚未见微重力生物反应器培养MSCs形成球形体对MSCs干性影响的相关研究报道。因此，本研究应用微重力生物反应器对ADSCs进行球形体培养，明确微重力生物反应器内球形体培养对ADSCs干性的影响。
　　方法:
　　1.本研究采用无酶分离法和胶原酶消化法从脂肪抽吸术的人脂肪组织中分离培养ADSCs，并应用细胞贴壁培养、流式细胞分析、免疫荧光和诱导分化等方法分别从细胞形态、免疫表型、胚层来源和多向分化潜能等方面鉴定分离的细胞。
　　2.运用微重力生物反应器对ADSCs进行球形体培养，对照分析球形体培养与单层培养ADSCs在增殖能力、多能性基因表达、克隆形成率、多向分化潜能等干性指标上的差异，明确微重力生物反应器内细胞球形体培养对ADSCs干性的影响。
　　3、统计学分析:数据收集采用Excel2007，统计分析使用SPSS13.0统计学软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间进行方差分析。
　　结果:
　　1.采用自行改良和建立的无酶分离法可从脂肪抽吸术的人脂肪组织中成功获得具备自我更新和多向分化潜能特性的ADSCs;
　　2.ADSCs在微重力生物反应器内培养可自发聚集形成直径小于200μm的细胞球形体，并球形体内绝大部分细胞保持活性;
　　3.与单层培养相比较，微重力生物反应器内球形体培养可显著上调ADSCs多能性基因如Oct4，Nanog，Sox-2和Rex-1的mRNA和蛋白表达;
　　4.微重力生物反应器内球形体培养来源ADSCs的细胞增殖能力和克隆形成率明显高于持续单层培养的ADSCs;
　　5.在合适的诱导培养条件下，球形体培养来源ADSCs不仅向中胚层成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞分化效率更高，其转分化为中胚层肝细胞和外胚层神经元细胞的效率也明显高于持续单层培养的ADSCs;
　　6.微重力生物反应器内球形体培养可上调ADSCs的E-Cadherin表达。
　　结论:
　　1.改良和建立了一种无酶分离ADSCs的方法，高效简便，分离的细胞易于扩增培养，有望为多种疾病的细胞治疗提供丰富的干细胞来源。
　　2.微重力生物反应器内球形体培养是提高ADSCs干性特征的有效体外培养方法，其作用机制尚待进一步深入研究。