抗抑郁药物对实验性脑损伤大鼠的保护作用及机制研究

摘要

背景：
　　创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）于全球范围内都是45岁以下年轻人群首要致死和致残病因，TBI后最容易被临床医生所忽视的是精神情感障碍。外伤后抑郁（Post-trauma Depression）作为脑外伤后最常见的神经精神后遗症，目前发生机制尚不明确，也没有疗效明确的治疗手段。
　　在奖励机制、认知、唤醒等方面发挥着重要作用的多巴胺（Dopamine，DA）被认为在抑郁症的发生过程中扮演着关键角色。TBI所造成的继发性脑损伤可能破坏黑质-纹状体通路（Nigrostriatial Pathway），阻碍多巴胺能神经元转运分泌的功能，从而影响中枢神经系统多巴胺系统的功能。我们推断 TBI后抑郁的发生和脑内黑质-纹状体通路稳态的破坏密切相关。金刚烷胺，作为临床上应用于帕金森病（Parkinson’s disease，PD)的药物，具有增加多巴胺生成和抑制多巴胺重摄取的作用。近年来，金刚烷胺应用于TBI后意识、认知、运动等功能恢复中的作用引起了学术界的广泛关注。上述证据提示金刚烷胺可能成为TBI后有效的抗抑郁药物。
　　脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)作为死残率极高的突发性疾病，迄今尚无有效的干预策略和治疗手段。ICH造成的局部血肿不仅可以对出血周围脑组织造成直接的应力压迫效应，而且在数小时到数天内引发继发性脑损伤（secondary brain injury）。大量的证据显示继发性脑损伤可能造成迟发性神经功能缺损（delayed neurological deficit），血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的破坏及白质纤维束的断裂，而针对继发性脑损伤的治疗是有一定的治疗时间窗。目前探索针对早期脑损伤（early brain injury，EBI）有保护作用的治疗手段显得格外的关键。
　　亚低温治疗作为一种综合治疗手段，已经用于多项临床转化。但最近三项关于物理性亚低温治疗脑外伤的多中心随机临床试验结果都宣告失败，这可能和物理降温属于外源性体温调节导致的寒颤引发应激反应，激活交感神经，释放儿茶酚胺，减少局部脑供血量相关。8-OH-DPAT,药理作用和选择性五羟色胺再摄取抑制剂类抗抑郁药物（Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI）所类似，神经保护作用逐渐被研究者们所认识。化学性降温作用于内源性体温调整系统，直接作用于下丘脑视前区-下丘脑前部（preoptic anterior hypothalamus,PO/AH），较物理性降温的降温过程更符合生理过程。
　　第一部分、脑外伤后抑郁发生机制及干预
　　目的：
　　研究脑外伤后脑内多巴胺水平对外伤后抑郁发生的影响，并探究金刚烷胺对外伤后抑郁样行为的治疗效果
　　材料和方法：
　　1、健康成年雄性SD大鼠296只，随机分为4组：假手术组、TBI组、金刚烷胺低剂量治疗组和金刚烷胺高剂量治疗组。治疗组术后1小时第1次腹腔注射，之后每8小时给药1次，高剂量组每日注射金刚烷胺135mg/kg，低剂量组每日注射45mg/kg，Sham组和TBI组动物予以等量生理盐水作为对照。
　　2、TBI后7d，14d，28d完成头颅磁共振成像，观察动物脑挫伤程度。
　　3、TBI后3d，7d，14d，28d进行行为学实验（蔗糖摄取，旷场试验，强迫游泳），评估动物TBI后抑郁样行为。
　　4、4％多聚甲醛灌注后取脑组织，固定脱水后，完成HE染色，Fluoro-Jade C染色观察TBI后神经元形态。
　　5、Western Blot法定量检测TBI后中脑黑质区tyrosine hydroxylase(TH)活性。
　　6、免疫荧光技术观察中脑黑质区多巴胺能神经元TBI后凋亡。
　　7、高效液相色谱-电化学法检测TBI后3h，6h，12h，24h，3d，7d，14d，28d伤侧大脑纹状体多巴胺及其代谢产物（DOPAC和HVA）含量。
　　结果：
　　1、TBI后7d，14d，28d，TBI组、TBI+A45组和TBI+A135组各组组间动物脑挫伤体积无明显差异。
　　2、与Sham组相比，TBI组于伤后3d，7d，14d，28d抑郁样行为显著增加，而金刚烷胺治疗有效地改善了各个时间点动物呈现出的抑郁样行为。
　　3、HE染色显示TBI7d各组纹状体病理形态无明显差异。FJC染色显示手术后7d，TBI组纹状体和中脑黑质神经元大量变性，而金刚烷胺治疗有效地减少了中脑黑质神经元变性但对纹状体神经元变性无显著性治疗效果。
　　4、WesternBlot结果提示：TBI组较Sham组动物中脑黑质区TH表达量明显下调（P＜0.05），金刚烷胺治疗有效地逆转了TH的下调趋势。
　　5、中脑黑质区免疫荧光染色显示：TBI组大量的多巴胺能神经元发生凋亡，而金刚烷胺治疗组多巴胺神经元凋亡被有效的抑制了。
　　6、TBI后各个时间点大脑纹状体经高效液相色谱-电化学法测定多巴胺及其代谢产物（DOPAC和HVA）提示：TBI后3h，多巴胺能神经递质有一过性的升高，而在亚急性期及慢性期都呈现持续性下降趋势，只在14d有过反弹性的增高。慢性金刚烷胺的治疗可以有效地逆转这种下降趋势。
　　结论：
　　1、实验性TBI动物在伤后不同时间点呈现出不同程度的抑郁样行为，金刚烷胺治疗有效地改善了TBI所致的抑郁样行为。
　　2、TBI后直接作用的纹状体区，HE染色显示：大量的神经元坏死，细胞间水肿明显，FJC染色证明大范围地出现神经元变性。金刚烷胺治疗组纹状体病理形态和TBI组无显著性差异。
　　3、TBI后，动物中脑黑质区多巴胺能神经元变性凋亡明显，同时中脑黑质TH活性明显下调。予以金刚烷胺治疗后，中脑黑质变性及凋亡的多巴胺能神经元明显减少，TH的活性显著上调。
　　4、高效液相色谱-电化学法结果显示：TBI动物纹状体内多巴胺及其代谢产物含量呈下降趋势，而金刚烷胺治疗可以逆转TBI后纹状体多巴胺水平的降低。
　　第二部分、化学降温剂对脑出血早期脑保护研究
　　目的：
　　本课题旨在8-OH-DPAT发挥的降温作用对ICH后EBI及BBB的破坏是否具有保护作用，并比较化学性降温剂和物理性亚低温治疗对ICH动物的脑保护效果。
　　材料和方法：
　　1、健康成年雄性SD大鼠207只，随机分为假手术组（Sham）、脑出血组（ICH）、8-OH-DPAT治疗组（DPAT）、物理性亚低温治疗组（HYPO）。DPAT组术后6小时完成第1次腹腔给药，之后每天腹腔注射8-OH-DPAT（1mg/kg）。HYPO组于术后6小时开始亚低温治疗,每日治疗12小时。Sham组和ICH组动物予以等量生理盐水作为对照。
　　2、ICH后24h，72h进行神经功能评分和转杆试验，观察运动功能缺损。
　　3、伤后7d进行Morris水迷宫试验，评估动物ICH后学习记忆能力。
　　4、ICH后6h，12h，24h，72h分别测量核心体温和颅脑体表温度。
　　5、术后72h电镜观察海马区神经元亚显微形态和结构。
　　6、ICH后24h，72h分别测量动物脑水含量及BBB通透性。
　　7、ICH后72h，应用Western Blot法检测出血灶周围IL-1β及TNF-α表达量。
　　结果：
　　1、大鼠ICH模型可在早期造成神经功能和学习记忆障碍，伴随脑温局部性升高。
　　2、自体血注射模型引起显著的急性脑水肿和BBB破坏，伴随海马神经元大量变性坏死，出血周围炎症因子表达增加。
　　3、物理性亚低温治疗一定程度上改善了ICH造成的神经功能和学习记忆能力缺损，保护海马区神经细胞免于变性坏死，但对ICH造成的早期BBB破坏的保护效果不明确。
　　4、8-OH-DPAT治疗对ICH后脑温升高的调节过程平缓且持续，可以有效地减轻ICH后动物神经功能和学习记忆能力的损伤，保护了ICH造成的BBB通透性增加，减少了血肿周围炎症因子的表达。
　　结论：
　　1、大鼠ICH模型在损伤早期可造成脑温升高，同时引起神经功能缺损和学习记忆能力降低，伴随BBB的破坏和海马区神经元坏死，提示脑温异常可以是早期脑损伤的重要机制。
　　2、化学性降温剂8-OH-DPAT在ICH早期的脑保护作用优于物理性亚低温治疗，可以有效地保护 BBB的损伤，减少神经元的变性坏死，减轻脑水肿发生，改善动物ICH后神经功能和学习记忆能力的缺损，说明直接作用于体温调节中枢的温度干预可能成为中枢神经系统损伤的一个新的治疗靶点。

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第一章 前 言

第二章 脑外伤后抑郁发生机制及干预

2.1 材料与方法

2.1.1 动物和仪器

2.1.2 动物与分组

2.1.3 动物麻醉

2.1.4 TBI动物模型手术过程

2.1.5 基础生理指标

2.1.6 核磁共振成像

2.1.7 蔗糖摄取试验

2.1.8 强迫游泳试验

2.1.9 旷场试验

2.1.10 标本取材和固定

2.1.11 HE染色

2.1.12 Fluoro-Jade C染色

2.1.13 Western Blot检测TBI后中脑黑质TH活性

2.1.14 免疫荧光染色

2.1.15 高效液相色谱-电化学检测法

2.1.16 统计学处理

2.2 结果

2.2.1 TBI后动物基础生理指标

2.2.1 MRI测量TBI挫伤体积

2.2.2 TBI后动物抑郁样行为评价

2.2.3 TBI挫伤灶周围脑组织形态学观察

2.2.4 TBI后纹状体及中脑黑质神经元变性观察

2.2.5 TBI后中脑黑质TH活性

2.2.6 TBI后中脑黑质多巴胺能神经元凋亡观察

2.2.7 TBI动物纹状体多巴胺能神经递质水平检测

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 化学降温剂对脑出血早期脑保护研究

3.1 材料与方法

3.1.1 动物和仪器

3.1.2 材料与主要试剂

3.1.3 动物与分组

3.1.4 动物麻醉

3.1.5 ICH动物模型手术过程

3.1.6 基础生理指标

3.1.7 神经功能评分

3.1.8 Morris水迷宫

3.1.9 脑温监测

3.1.10 透射电子显微镜观察

3.1.11 脑组织水含量测量

3.1.12 伊文思蓝法测量BBB通透性

3.1.13 胶体金测量BBB通透性

3.1.14 Western Blot检测出血灶周围脑组织IL-1β及TNF-α水平

3.1.15 统计学处理

3.2 结果

3.2.1 ICH后动物基础生理指标

3.2.2 ICH后脑组织大体标本

3.2.3 ICH动物神经功能评价

3.2.4 Morris水迷宫检测ICH后动物学习记忆能力

3.2.5 ICH后体温监测

3.2.6 透射电子显微镜观察ICH后动物海马区神经细胞病理形态

3.2.7 ICH动物脑组织水含量测量

3.2.8 伊文思蓝法测量ICH动物BBB通透性

3.2.9 胶体金法测量ICH动物BBB通透性

3.2.10 Western Blot检测ICH动物出血灶周围TNF-α及IL-1β的表达量

3.3 讨论

3.4 小结

参考文献

文献综述:多巴胺在抑郁症的作用研究进展

攻读博士期间发表的论文

致谢