CD20+B细胞在胃癌中的分布、表型及免疫功能的初步研究

摘要

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤中其发病率和死亡率均位居前三。胃癌免疫一直伴随着胃癌的发生发展及临床转归，而胃癌组织中免疫细胞的浸润及其功能调控则是影响胃癌进展的关键因素。
　　目前研究证实，在胃癌微环境中，包括调节性T细胞、髓样来源的抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞等在内的多个免疫细胞群参与促进胃癌的进展，而CD8+T细胞和NK细胞等作为抗肿瘤效应性细胞在抵抗胃癌进展中发挥了重要作用。近年关于乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、非小细胞肺癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的研究发现，一群表达CD20的B细胞即CD20+B细胞在肿瘤组织中大量浸润，且肿瘤浸润的CD20+B细胞与患者的预后密切相关。然而，在胃癌微环境中是否存在着CD20+B细胞的浸润及其发挥怎样的免疫功能并不清楚。因此，本文拟对CD20+B细胞在胃癌中的分布、表型特征及免疫调控功能进行初步研究，以期为发展胃癌的免疫治疗方案提供新的实验证据。
　　目的：
　　1.明确CD20+B细胞在胃癌中的分布和表型特征。
　　2.初步研究CD20+细胞在胃癌中的免疫调控功能。
　　方法：
　　1.CD20+B细胞在胃癌中的分布和表型特征表达研究
　　收集重庆第三军医大学西南医院普外科30例胃癌患者手术切除的组织标本（同一患者的癌组织、癌旁组织和正常组织）和外周血。利用流式细胞术检测CD20+B细胞的比例和数目。流式细胞术分析CD20+B细胞表面受体和功能相关分子(CD80、CD86、CD40、IgM、IgG、HLA-ABC、HLA-DR、IgD、CD39、CD73、CD69、TRAIL)和趋化因子受体表达情况。同时用免疫组织化学染色技术检测CD20+B细胞在癌组织和正常组织中的分布情况。
　　2.CD20+B细胞在胃癌中免疫功能的初步研究
　　流式分选胃癌组织和正常组织中的CD20+B细胞以及分选相同患者的外周血T细胞，按1∶1比例进行体外共培养，5天后流式细胞术检测其中的T细胞增殖和IFN-γ的表达情况。此外，利用免疫组织化学双重染色对癌组织中CD20+B细胞与IL-10进行共定位检测。
　　3.统计学方法
　　采用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析，多个组之间的比较采用单因素方差分析，两组之间的比较采用T检验，P＜0.05具有统计学差异。
　　结果：
　　1.CD20+B细胞在胃癌中的分布结果
　　1.1流式细胞术检测胃癌患者不同标本中CD20+B细胞的比例:在30例被检标本中，其外周血、正常组织、癌旁组织、癌组织CD20+B细胞占CD45+细胞比例均值分别为2.27％±0.35％、8.86％±1.55％、9.23％±1.46％、17.92％±2.24％。统计分析表明:胃癌组织中的CD20+B细胞比例与外周血、正常组织及癌旁组织相比较均具有显著性统计学差异(P＜0.001，P=0.002，P=0.002)，癌旁组织和正常组织中CD20+B细胞的比例与外周血相比较均具有显著性统计学差异(P＜0.001)，而癌旁组织中CD20+B细胞的比例与正常组织相比较并无显著性统计学差异(P=0.863)。
　　1.2免疫组化染色结果经统计学分析显示:癌组织中的CD20+B细胞数目与正常组织相比较具有极显著统计学差异(P＜0.01)。
　　1.3胃癌患者CD20+B细胞的表型检测结果
　　1.3.1 CD20+B细胞表面免疫球蛋白分子的表达结果
　　胃癌患者外周血和不同组织中CD20+B细胞均表达IgM和IgD而不表达IgG，但组织中CD20+B细胞表达的IgM和IgD显著低于外周血，提示组织中的CD20+B细胞为成熟的B细胞。
　　1.3.2 CD20+B细胞表达CD5及共刺激分子的表达结果
　　胃癌组织、正常组织中CD20+B细胞不表达CD5分子。
　　胃癌组织、正常组织和外周血中CD20+B细胞表达HLA-ABC、HLA-DR和CD40但低表达CD80、CD86。与正常组织和外周血相比，胃癌组织中的CD20+B细胞低表达HLA-ABC和CD40，提示胃癌微环境中的CD20+B细胞激活CD8+T细胞的能力较弱。
　　1.3.3CD20+B细胞功能相关分子的表达结果
　　胃癌组织、正常组织和外周血中CD20+B细胞均不表达TRAIL和PD-L1;与外周血相比，胃癌组织和正常组织中的CD20+B细胞高表达CD69和PD-L1但低表达CD62L，CD39和CD73;而与正常组织相比，胃癌组织中CD20+B细胞更低表达CD73。
　　1.3.4 CD20+B细胞增殖能力Ki-67表达结果
　　癌组织中表达Ki-67的CD20+B细胞比例显著高于外周血，但癌组织和正常组织中表达Ki-67的CD20+B细胞比例则无明显差异。趋化因子受体表达情况:外周血和癌组织中CD20+B细胞均不表达CXCR1、CXCR2和CXCR3，但均高表达趋化因子受体CXCR4，尽管外周血中CD20+B细胞高表达CXCR5，但癌组织中CD20+B细胞不表达CXCR5。
　　2.CD20+B细胞在胃癌中免疫功能的初步研究结果
　　2.1 CD20+B细胞与CD3+T细胞共培养实验结果显示:与正常组织对照组相比较，胃癌组织试验组中CD3+T细胞增殖比例下降，而且增殖的CD3+T细胞表达IFN-γ的比例也下降，提示胃癌组织中的CD20+B细胞能够抑制CD3+T细胞的增殖及其IFN-γ的表达。
　　2.2免疫组化双重染色结果显示:胃癌组织中CD20分子与IL-10在B细胞存在共表达。
　　结论：
　　1.胃癌组织中CD20+B细胞占CD45+细胞的比例显著高于癌旁组织、正常组织和外周血。免疫组化染色亦表明胃癌组织中的CD20+B细胞数量显著高于正常组织。CD20+B细胞在胃癌组织中显示出一定的免疫抑制表型倾向，并高表达趋化因子受体CXCR4。
　　2.胃癌组织来源的CD20+B细胞能够抑制T细胞的增殖和IFN-γ的表达，且胃癌组织中的CD20+B细胞可表达IL-10，提示胃癌浸润的CD20+B细胞具有免疫抑制功能，其可能机制是通过表达IL-10实现。

目录

声明

英文缩略表

摘要

第一章 前言

第二章 CD20+B细胞在胃癌中的分布及表型研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 CD20+B细胞在胃癌中免疫功能的初步研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表的论文

致谢