多巴胺D1类受体对对氧磷酶2的调节在肾脏细胞氧化应激中的作用

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 多巴胺D1类受体对对氧磷酶2的调节在肾脏细胞氧化应激中的作用
　　目的：研究多巴胺D1R和D5R对PON2的调节在肾脏细胞氧化应激中的作用。
　　方法：1.以小鼠肾脏切片以及D1R转染HEK-293细胞(HEK-hD1R)及D5R转染HEK-293细胞(HEK-hD5R)以及hRPT细胞为研究对象，采用免疫荧光的方法，在激光共聚焦显微镜下观察多巴胺D1R与PON2以及D5R与PON2的各自表达情况以及是否存在共定位现象;多巴胺D1类受体激动剂fenoldopam短效刺激(1μM，15 min)后，D1R与PON2，D5R与PON2共定位现象是否发生改变。
　　2.以HEK-hD1R、HEK-hD5R及hRPT细胞为研究对象，采用蔗糖密度梯度离心法提取细胞膜LRs及non-LRs组分，用免疫印迹法检测蛋白表达，观察fenoldopam(1μM，15 min)或胆固醇消耗剂甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin，βCD)(2％，60 min)对 PON2在细胞膜LRs及non-LRs分布的影响。
　　3.在HEK-hD1R、HEK-hD5R细胞上，用免疫印迹法观察fenoldopam刺激不同时间（1μM，2-24 h）对PON2蛋白表达的影响，以及用D1类受体阻断剂SCH23390(1μM，24 h)对PON2变化的影响。定量PCR方法观察fenoldopam长效刺激（1μM，24 h）对PON2基因转录的影响。
　　4.用免疫印迹法观察D5R基因敲除小鼠肾脏皮质PON2表达变化;在hRPT细胞上，用D5R-siRNA沉默D5R基因，免疫印迹法检测转染效果，观察对PON2、NOX2表达以及ROS生成的影响。
　　5.用PON2-siRNA转染细胞沉默PON2基因，用H2DCFDA荧光法测ROS生成及光泽精发光法检测NADPH氧化酶活性，分别观察PON2在fenoldopam长效刺激(1μM，24 h)调节ROS生成及NADPH氧化酶活性中的作用。
　　结果：
　　1.为了解D1类受体与PON2的作用是否通过直接的物理连接实现，我们首先进行了共定位检测。结果发现D1R、D5R与PON2在小鼠肾脏近端小管刷状缘上表达丰富，D1R与PON2以及D5R与PON2在小鼠肾脏近端小管刷状缘存在共定位;在hRPT以及HEK-hD1R、HEK-hD5R细胞上，基础状态下D1R和D5R主要表达于细胞膜和细胞浆内，PON2主要表达在细胞浆内，D1R与PON2以及D5R与PON2有部分共定位，fenoldopam短效刺激促进D1R和D5R的内化，与PON2在细胞浆内的共定位增加。
　　2.我们推测D1类受体对PON2的调节可能有细胞膜LRs参与。通过蔗糖密度梯度离心法，观察到在HEK-hD1R细胞上，fenoldopam短效刺激导致LRs及non-LRs内PON2蛋白含量均升高;在HEK-hD5R及hRPT细胞上，fenoldopam刺激仅升高non-LRs内PON2蛋白含量而对LRs内PON2含量无明显影响。在这三种细胞上，βCD均能促进PON2从LRs向non-LRs组分内转移。这体现了D1R与D5R调节PON2的不同作用，可能与D1R与D5R不同的抗氧化机制相关。
　　3.为检测PON2在D1受体长效抗氧化应激中的作用，首先观察长效激动D1类受体对PON2表达的影响。在HEK-hD5R细胞上，fenoldopam刺激可呈现时间依赖性地增加PON2蛋白表达，并且该效应可被D1类受体阻断剂逆转，而在HEK-hD1R细胞上，fenoldopam刺激对PON2蛋白表达无明显影响。Fenoldopam长效刺激还可升高HEK-hD5R细胞PON2mRNA表达而对HEK-hD1R细胞无影响。这也证明了D1R与D5R对PON2的差异性调节。
　　4.D5R基因敲除小鼠PON2表达下降;在hRPT细胞上，D5R-siRNA转染细胞PON2表达下降、NOX2表达上调;D5R-siRNA转染细胞ROS生成增加，该作用可被apocynin逆转。
　　5.在hRPT细胞上，PON2-siRNA明显削弱了fenoldopam长效刺激对NADPH氧化酶活性及ROS生成的抑制作用。
　　结论：D1R和D5R通过对PON2的不同调控机制，以及在短效、长效作用中的不同作用发挥对氧化应激的差异性调节。其中，在短效作用中，D1R可通过上调LRs内PON2表达参与抗氧化调节，而D5R则促使PON2向non-LRs转位，可能通过其他的作用机制参与抑制氧化应激。在长效作用中，D1R对PON2表达无影响，而D5R通过上调PON2表达发挥抗氧化作用。本研究阐释了D1类受体在抗氧化作用中的新机制，以及受体亚型的差异性作用，为药物治疗提供了新的靶点。
　　第二部分 多巴胺D3受体与血管紧张素Ⅱ2型受体的交互作用对肾脏水钠排泄的影响
　　目的：研究多巴胺D3R与AT2R的交互作用对肾脏水钠排泄的影响及机制研究。
　　方法：1.采用肾动脉灌注技术，观察D3R受体激动剂PD128907和AT2R受体激动剂CGP42112A单独灌注及共同灌注对Wistar大鼠肾脏水钠排泄的影响，并在D3R受体阻断剂U99194A或AT2R受体阻断剂PD123319联合灌注时，观察PD128907及CGP42112A单独及共同灌注利尿排钠作用的变化。
　　2.用哇巴因法检测PD128907和CGP42112A单独刺激或共同刺激WKY RPT细胞对Na+-K+-ATP酶活性的影响，并在U99194A或PD123319联合刺激时，检测PD128907及CGP42112A分别及联合刺激对Na+-K+-ATP酶活性影响的变化。
　　3.采用免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下观察Wiser大鼠肾脏以及WKYRPT细胞上D3R与AT2R的各自表达情况，以及是否存在共定位，PD128907、CGP42112A单独或共同刺激后，共定位是否发生改变。
　　4.探索WKY RPT细胞上D3R与AT2R相互作用的机制。
　　结果：1.为观察激活肾脏D3R与AT2R是否在大鼠体内交互作用而产生利尿排钠效应，我们首先通过肾灌注PD128907及CGP42112A，观察尿量及尿钠排泄变化。结果显示在Wistar大鼠上分别灌注PD128907与CGP42112A可产生促进水钠排泄的作用，并且分别被D3R或AT2R阻断剂所阻断。两药共同灌注可产生协同增强的排钠利尿作用，该作用可被D3R或AT2R受体阻断剂逆转。证明了共刺激D3R或AT2R可引起协同放大的促水钠排泄作用，并且与D3R或AT2R特异性相关。
　　2.为检测D3R与AT2R在离体细胞实验中是否也存在交互作用而促进钠排泄，我们通过哇巴因法测定PD128907与CGP42112A对WKY RPT细胞Na+-K+-ATP酶活性的影响。结果显示PD128907与CGP42112A分别刺激WKY RPT细胞均可抑制Na+-K+-ATP酶活性，并呈现时间依赖性，该效应可分别被D3R或AT2R阻断剂逆转。PD128907与CGP42112A共同刺激时产生协同增强的抑制效应，D3R或AT2R阻断剂可阻断该效应。证明共刺激D3R或AT2R可以协同抑制Na+-K+-ATP酶活性，并且与D3R或AT2R受体特异性相关。
　　3.因为D3R与AT2R信号传导均与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)相关，因此我们在机制研究中，观察了PD128907与CGP42112A共作用对磷酸化ERK的影响。结果显示共刺激D3R和AT2R时，磷酸化ERK表达协同增强，MAPK-ERK信号通路可能参与了D3R和AT2R的协同效应。再用MAPK抑制剂PD98059联合用药，观察对D3R和AT2R协同效应有无阻断作用。结果显示PD98059可逆转PD128907与CGP42112A共刺激对D3R和AT2R共定位及共连接的增强作用，并阻断了对Na+-K+-ATP酶活性的协同抑制效应。证明MAPK-ERK信号通路参与了D3R和AT2R协同效应。
　　结论：我们的研究表明，D3R与AT2R存在交互作用，共刺激时通过促进D3R或AT2R的正向交互作用、对Na+-K+-ATP酶活性的协同抑制，产生协同放大的利尿排钠效应，该效应与MAPK-ERK信号通路相关。本研究证明了多巴胺受体与血管紧张素Ⅱ受体的交互作用也可产生协同效应，这种同向的调节活动与受体间交互作用的增强以及协同激活共同信号通路相关。说明外周多巴胺系统与RAS之间除了相互拮抗发挥调节作用外，还可通过互相促进、协同增强的方式同向参与水钠调节。本研究揭示了多巴胺系统与RAS之间在水钠排泄中新的作用机制，为高血压的防治提供了新的依据。

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摘要

第一部分 多巴胺D1类受体对对氧磷酶2的调节在肾脏细胞氧化应激中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 多巴胺D3受体与血管紧张素Ⅱ2型受体的交互作用对肾脏水钠排泄的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

文献综述 肾脏多巴胺系统与肾素-血管紧张素系统的交互作用在血压调控中的作用

攻读博士期间发表论文

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