荔枝核乙酸乙酯相抑制HepG2细胞增殖及其抗肝癌免疫调节机制研究

摘要

1.研究目的与意义
　　本研究的目的是对荔枝核乙酸乙酯相(Litch seeds ethyl aetate,LEA)进行成分提取与分离，在前期研究基础上通过体外实验对比HepG2和MCF-7的抑瘤作用，筛选出对LEA敏感的细胞株HepG2细胞，并进一步探讨LEA对HepG2细胞的增殖影响及其诱导凋亡机制；其次是阐明LEA在体内抑制H22实体瘤小鼠的免疫调节机制，该成果将为荔枝核有效成分的药理药效深入研究提供基础。
　　本研究的意义在于初步筛选出的LEA具有抑制肝癌细胞增殖的作用，在确定可抑制肿瘤细胞增殖的基础上，分析其可能的药效成分为总黄酮类化合物，这将为荔枝核抗肿瘤药理作用的深入研究及新药研发提供有应用价值的基础数据。
　　2.研究方法
　　2.1.LEA的提取、分离及有效成分鉴别
　　本实验采用70％乙醇浸提，并结合超声助提的方法获取荔枝核总化合物成分，再通过萃取分离、干燥获得 LEA，作为抗肿瘤实验的药物成分；再采用盐酸-镁粉反应方法鉴别LEA中的总黄酮成分，同时采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量。
　　2.2.LEA对HepG2、MCF-7细胞增殖抑制作用
　　本研究通过对比肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF-7细胞的抑瘤效果，利用不同浓度的LEA分别作用于肿瘤细胞24h和48h后，采用MTT法检测LEA对肿瘤细胞的增殖抑制率并绘制抑制曲线；结晶紫染色法对 LEA作用肿瘤细胞之后细胞形态学变化观察，从中选取 LEA作用效果最佳的肿瘤细胞系，然后进行体内的抗肿瘤相关机制研究。
　　2.3.LEA对小鼠淋巴细胞的增殖影响
　　为了探讨 LEA对正常淋巴细胞的影响，采用小鼠原代脾脏淋巴细胞、胸腺淋巴细胞、腹腔巨噬细胞作为实验对象，利用不同浓度的LEA分别作用于淋巴细胞24h和48h后，采用MTT法检测LEA对淋巴细胞的增殖的影响并绘制曲线图；分析确定LEA对正常淋巴细胞无毒性作用的药效浓度以及可以增强淋巴细胞活性的淋巴细胞。
　　2.4.LEA对共培养体系的影响研究
　　通过LEA对小鼠淋巴细胞的增殖筛选，选择脾脏淋巴细胞与HepG2细胞（3:1）的比例进行共培养，LEA作用24h后，吸出悬浮的淋巴细胞和含药物的培养液，MTT法检测肿瘤细胞的增殖抑制率并绘制抑制曲线。研究 LEA对共培养体系的影响，是为探讨药物对瘤细胞及淋巴细胞共存时的药效变化，为体内实验提供基础。
　　2.5.LEA诱导肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制
　　采用流式细胞术、DNA Ladder研究LEA对HepG2细胞的凋亡机制，在不同浓度LEA作用24h后，采用Annexin-V/PI双染凋亡检测HepG2细胞的总凋亡率，再通过DNA Ladder实验是否形成明显的梯状条带，以此判断LEA是否诱导HepG2细胞发生凋亡，以及采用罗丹明123检测LEA诱导HepG2细胞凋亡过程中线粒体?Ψm的前后变化。
　　2.6 LEA对荷瘤小鼠免疫系统的影响
　　使用BALB/c小鼠腋下接种H22细胞以构建肝癌实体瘤造模。分别采用不同浓度LEA和5-Fu对肝癌小鼠进行治疗，分为模型组、阳性对照组、药物（高、中、低）剂量组，灌胃给药1次/d,连续10天。每天观察小鼠生活状态，实验结束后将各组小鼠眼球取血备用，完整剥离瘤块、胸腺和脾脏并称重,计算抑瘤率和器官指数，同时使用MTT法测定肿瘤小鼠脾脏淋巴、胸腺淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的增殖指数；ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α、INF-γ的分泌情况。
　　3.研究结果
　　3.1.LEA提取与鉴定
　　经过荔枝核干燥醇提萃取获得 LEA，经紫外分光光度法鉴定，LEA总黄酮含量（以芦丁计）为0.91mg/ml，荔枝核粗提取物总黄酮含量（以芦丁计）为0.21mg/ml。由此可见LEA的总黄酮含量明显高于荔枝核粗提取含量。
　　3.2.LEA对HepG2、MCF-7细胞的作用
　　LEA作用HepG2、MCF-7细胞，24h较48h明显，IC50分别为为59.52μg/ml、301.7μg/ml；在经过结晶紫染色法鉴定，药物浓度在30μg/ml-240μg/ml范围内，药物浓度越高，贴壁细胞越少，结晶紫染色就越浅。通过以上结果比较，LEA对 HepG2细胞的抑制效果比MCF-7明显，下一步的实验将确定HepG2细胞为药物作用细胞系。
　　3.3.LEA对小鼠脾脏淋巴细胞的影响
　　LEA在60μg/ml时对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖率达到了321.33%，与对照组相比有显著性(P<0.01)，说明LEA在30μg/ml-240μg/ml浓度区间，对正常淋巴细胞无毒性，超过240μg/ml，细胞状态改变，异常堆积，无法清晰看出细胞椭圆形态，说明高浓度可能有毒性，因此，LEA的浓度选择在30μg/ml-240μg/ml范围内进行下一步实验。
　　3.4.LEA作用共培养体系的影响研究
　　在共培养体系中，选择小鼠脾淋巴细胞与HepG2细胞共培养，单独选用LEA为60μg/ml时对HepG2细胞的抑制率为35.28%，当LEA加入共培养系时抑制率达可到72.34%，抑制效果明显增强。说明 LEA可能通过促进淋巴细胞活化而更好的抑制肿瘤生长。
　　3.5.流式细胞术检测LEA诱导肝癌HepG2细胞凋亡
　　Annexin-V/PI双染凋亡检测结果显示，当LEA为60μg/ml时作用脾细胞与肝癌HepG2细胞共培养体系24h，总凋亡率达可达到57.78%。
　　3.6.LEA对荷瘤小鼠免疫功能的影响
　　采用Mouse IL-1β ELISA试剂盒测定，得荷瘤小鼠中剂量组(30g/kg)的血清IL-1β的含量为49.79 pg/ml；中剂量组的荷瘤小鼠脾脏上清液IL-1β的分泌含量为46.32 pg/ml，表明LEA在抑制肿瘤增长的同时并对IL-1β具有促进分泌作用，提示LEA可能通过上调IL-1β分泌水平防止淋巴细胞抗肿瘤反应被抑制，增强机体免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡。
　　4.结论
　　4.1.本课题通过醇提萃取方法对LEA进行提取、分离，经紫外分光光度法鉴定总黄酮含量为0.91mg/ml。
　　4.2.确定LEA作用瘤细胞HepG2的IC50为59.52μg/ml，抑制HepG2细胞的有效浓度在30-120μg/ml之间，最大抑制率可达57.26%，并对正常淋巴细胞无毒性作用，可一定程度上起到活化免疫细胞的效应。
　　4.3.LEA作用小鼠脾淋巴细胞和肝癌HepG2细胞共培养体系，LEA为60μg/ml的抑制率达到72.34%，说明了共培养体系联合LEA能更好的发挥抑制HepG2细胞作用。
　　4.4.通过Annexin-V/PI双染对HepG2细胞凋亡进行检测，结果显示LEA为60μg/ml时作用脾细胞和肝癌HepG2细胞共培养体系24h时，总凋亡率可达到57.78%。进一步说明LEA不但可以单独抑制HepG2细胞的生长，同时还可以通过活化脾淋巴细胞，通过诱导瘤细胞凋亡而发挥抑制肿瘤生长的效应。
　　4.5.进一步体内LEA抑制H22实体瘤实验结果表明，中剂量组的抑瘤率可达到50.15%，测定免疫细胞分泌细胞因子情况，IL-1β表达明显增高，提示LEA可能通过上调IL-1β分泌水平而活化效应性淋巴细胞，达到诱导肿瘤细胞的凋亡结果。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

引言

参考文献

第一部分 研究背景与立题依据

一、研究背景

1 荔枝核概述

2 荔枝核化学成分的研究

3 荔枝核抑制肿瘤药理作用研究

4 荔枝核抑制肿瘤分子机制研究

5 荔枝核抗肿瘤免疫调节机制研究

6 前景和展望

参考文献

二、立题依据与研究内容

1 立题依据

2 研究内容

3 研究创新点

参考文献

第二部分 实验研究

第一章 LEA通过淋巴细胞介导的肿瘤抑制作用

第一节 LEA的提取及鉴别

第二节 LEA对HepG2、MCF-7细胞增殖的影响

第三节 LEA对小鼠淋巴细胞增殖的影响

第四节 LEA对淋巴细胞与肿瘤细胞共培养的影响

第二章 LEA通过淋巴细胞介导的HepG2细胞凋亡研究

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第三章 LEA体内抑制小鼠H22实体瘤实验

1 实验材料及仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

结论与展望

1 结论

2 不足

3 展望

附录

攻读学位期间发表的论文

致谢