胶质瘤细胞“干性”和生物学行为的分子调控机制及其治疗学意义

摘要

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)对胶质瘤的分类标准，按照其恶性程度可分为Ⅰ-Ⅳ级，其中胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）恶性程度极高，患者生存期短、复发率高、治疗困难。胶质瘤干细胞是胶质瘤中具有干细胞特性的瘤细胞亚群。研究表明，胶质瘤干细胞可以驱动胶质瘤成瘤、进行自我更新并分化成异质性的瘤细胞群体从而维持肿瘤生长。尽管胶质瘤干细胞在肿瘤中含量极微，却是维持胶质瘤增殖、侵袭和促血管生成等恶性生物学行为的关键。深入研究调控胶质瘤干细胞生物学特性的分子机制，并研发靶向胶质瘤干细胞的治疗策略将为提高胶质瘤患者治疗效果带来新的希望。
　　胶质瘤干细胞呈现干细胞样的生物学特征（以下简称“干性”），具体表现为:表达特定干细胞标志物（如SOX2、Olig2、CD133等），具有自我更新、多向分化和体内重建肿瘤的能力。“干性”是胶质瘤干细胞群体维持自身存在、扩增的基础，也是其发挥恶性生物学作用的关键。近年来研究发现，胶质瘤干细胞“干性”维持主要依赖于:1)特定干细胞标记物的表达;2）胶质瘤干细胞内特有的分子调控机制（包括基因组学调控、表观遗传学调控、转录组学调控等）;3）外界肿瘤微环境（如肿瘤相关巨噬细胞、血管细胞及其分泌的生长因子）与胶质瘤干细胞的相互作用。本研究通过基因表达谱芯片筛查，发现膜表面蛋白CD9在胶质瘤干细胞中高表达并作为胶质瘤干细胞新标记物。在胶质瘤干细胞内在调控机制方面，我们发现CD9、miRNA-663、miRNA-126在胶质瘤干细胞“干性”和恶性生物学行为（细胞增殖、侵袭和血管生成）中发挥调控作用。在肿瘤微环境调控方面，我们发现肿瘤相关巨噬细胞高表达定分泌PTN(Pleiotrophin)，后者与胶质瘤干细胞中其受体PTPRZ1结合，维持胶质瘤干细胞“干性”并促进肿瘤生长。
　　本研究的主要结果和意义如下:
　　1.CD9作为胶质瘤干细胞新标记物的筛选鉴定及其对胶质瘤干细胞“干性”维持和成瘤能力的影响:①CD9在胶质瘤干细胞中高表达并与胶质瘤干细胞标记物SOX2、Olig2和CD133存在共表达。②干扰CD9表达抑制胶质瘤干细胞自我更新能力和增殖能力。③干扰CD9表达抑制胶质瘤干细胞成瘤能力。
　　2.CD9对膜表面受体gp130稳定性的影响和调控机制:①CD9与gp130在胶质瘤干细胞中存在相互作用。②干扰CD9明显抑制gp130蛋白表达。③CD9通过防止gp130发生溶酶体泛素化降解而维持其稳定性。
　　3.CD9对gp130下游STAT3信号通路活性的影响:①干扰CD9表达明显抑制gp130下游STAT3信号通路活性。②持续活化型STAT3能够部分回复由于干扰CD9表达对胶质瘤干细胞“干性”和成瘤能力的抑制作用。
　　4.miRNA-663在胶质瘤中的表达水平及其预后判定价值:①相对于正常脑组织，miRNA-663在胶质瘤肿瘤组织中显著低表达，其表达水平与胶质瘤级别和恶性程度显著负相关。②miRNA-663表达是判断胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤患者预后的重要评价因子;其表达水平越高，患者预后越好。
　　5.miRNA-663对胶质瘤恶性表型的影响及分子机制:①过表达miRNA-663明显抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭能力，抑制颅内原位移植瘤生长。②PIK3CD和CXCR4是miRNA-663的靶基因。③过表达miRNA-663能够抑制PIK3CD和CXCR4蛋白表达水平。④胶质瘤组织中miRNA-663与PIK3CD或CXCR4的表达水平显著负相关。⑤miRNA-663抑制PIK3CD和CXCR4下游AKT信号通路活化和CCND1、MMP2、MMP7等增殖、侵袭相关效应分子的表达。⑥过表达PIK3CD和CXCR4能够部分回复miRNA-663对肿瘤增殖和侵袭的抑制作用。
　　6.miRNA-663基因治疗联合CXCR4抑制剂AMD3100的治疗效果评价:①多西环素诱导miRNA-663表达联合AMD3100，能够显著抑制移植瘤生长。②过表达miRNA-663联合AMD3100能够抑制CXCR4表达并阻断其功能，延长荷瘤鼠生存时间。
　　7.miRNA-126在胶质瘤干细胞中的表达及生物学功能:①miRNA-126在胶质瘤干细胞中显著低表达，并与胶质瘤干细胞“干性”标记物SOX2表达水平负相关。②过表达miRNA-126显著抑制胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力。③过表达miRNA-126抑制胶质瘤干细胞诱导的内皮细胞迁移运动能力和小管形成能力。④过表达miRNA-126明显抑制胶质瘤干细胞中VEGFA的表达和分泌，并抑制胶质瘤干细胞介导的肿瘤血管生成。
　　8.miRNA-126调控胶质瘤干细胞的分子机制:①HIP1是miRNA-126的靶基因。②过表达miRNA-126能够抑制HIP1蛋白表达。③HIP1促进胶质瘤干细胞“干性”维持、成瘤能力和促血管生成能力。④HIP1通过稳定EGFR表达，促进AKT和STAT3信号通路活性。⑤过表达HIP1部分回复miRNA-126对胶质瘤干细胞增殖、自我更新和促血管生成的抑制作用。⑥过表达HIP1部分回复miRNA-126对EGFR表达和AKT、STAT3信号通路活性的负向调控。
　　9.miRNA-126与抗血管生成药物贝伐单抗（Bevacizumab，Beva）联合应用对胶质瘤干细胞肿瘤生长的治疗效果:①多西环素诱导miRNA-126表达，显著抑制Beva对胶质瘤干细胞的富集作用。②miRNA-126诱导表达与Beva联合应用，显著抑制胶质瘤干细胞肿瘤生长。③miRNA-126诱导表达与Beva联合应用，显著延长荷瘤鼠生存时间。
　　10.胶质瘤组织中miRNA-126的表达水平及与肿瘤微血管面积和患者预后的关系:①相对于正常脑组织，miRNA-126在胶质瘤肿瘤组织中显著低表达，且其表达水平与胶质瘤级别显著负相关。②miRNA-126表达水平与胶质瘤肿瘤微血管面积显著负相关。⑧miRNA-126是预测胶质瘤患者预后的标记物。
　　11.肿瘤相关巨噬细胞源性分泌蛋白PTN的筛选鉴定及其在介导肿瘤相关巨噬细胞促瘤效应中的作用:①PTN是肿瘤相关巨噬细胞高表达和分泌的生长因子;②肿瘤相关巨噬细胞源性的PTN能够促进胶质瘤干细胞始动的肿瘤生长。
　　12.PTPRZ1在胶质瘤干细胞中的表达及PTN/PTPRZ1通路对胶质瘤干细胞“干性”维持和成瘤能力的影响及其治疗意义:①PTPRZ1在胶质瘤干细胞中高表达。②PTN/PTPRZ1通路促进胶质瘤干细胞自我更新能力和增殖能力。③干扰PTPRZ1表达抑制胶质瘤干细胞成瘤能力并延长荷瘤鼠生存期。④通过PTPRZ1抗体阻断PTN与PTPRZ1结合，能够抑制胶质瘤干细胞始动的肿瘤生长。
　　13.胶质瘤干细胞内PTN/PTPRZ1下游信号通路筛查与鉴定:①PI3K-AKT信号通路是PTN-PTPRZ1发挥作用的主要下游通路。②PTPRZ1与Fyn存在相互作用。③PTN/PTPRZ1激活，促进Fyn的磷酸化和下游AKT通路的活化。
　　综上所述，本研究的主要结论包括:
　　1.CD9作为胶质瘤干细胞膜标记物，其通过防止gp130发生溶酶体泛素化降解而维持gp130稳定性，促进胶质瘤干细胞中STAT3信号通路活化并维持胶质瘤干细胞“干性”和成瘤能力。
　　2.miRNA-663通过联合靶向CXCR4、PIK3CD表达，负向调控PI3K-AKT通路，进而抑制胶质母细胞瘤演进并影响患者的预后。
　　3.miRNA-126通过靶向HIP1，负向调控EGFR表达和AKT、STAT3信号通路活性，抑制胶质瘤干细胞自我更新及促血管生成作用，进而影响胶质瘤肿瘤生长。
　　4.肿瘤相关巨噬细胞分泌的PTN与胶质瘤干细胞中高表达的PTPRZ1结合，促进胶质瘤干细胞中Fyn-AKT信号通路活化，进而维持胶质瘤干细胞“干性”及肿瘤生长。
　　上述结果将为阐明胶质瘤细胞“干性”维持和生物学行为的分子调控机制、筛选胶质瘤干细胞标记物和制定靶向胶质瘤干细胞的治疗策略提供理论与实验依据。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 胶质瘤干细胞新标志物CD9及其调控作用与机制

2．1 胶质瘤干细胞新标记物CD9的筛选鉴定及其调控作用

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

2．2 CD9对膜表面受体gp130稳定性的影响和调控机制

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．2．4 小结

2．3 CD9对gp130下游STAT3信号通路活性的影响

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

2．3．4 小结

第三章 miRNA-663对胶质瘤增殖、侵袭的调控机制及其预后判断和治疗价值

3．1 miRNA-663在胶质瘤组织中的表达及临床病理学意义

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．1．4 小结

3．2 miRNA-663对胶质瘤增殖及侵袭能力的调控作用及机制

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．2．4 小结

3．3 miRNA-663联合CXCR4抑制剂AMD3100对胶质瘤移植瘤的治疗效果评价

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

3．3．4 小结

第四章 miRNA-126调控胶质瘤干细胞“干性”及肿瘤血管生成的机制及治疗学意义

4．1 miRNA-126对胶质瘤干细胞“干性”和肿瘤血管生成的影响

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

4．1．4 小结

4．2 miRNA-126调控胶质瘤干细胞“干性’’和肿瘤血管生成的分子机制

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．2．4 小结

4．3 miRNA-126与抗血管生成药物贝伐单抗的联合应用的治疗学意义

4．3．1 材料与方法

4．3．2 结果

4．3．3 讨论

4．3．4 小结

4．4 胶质瘤中miRNA-126表达水平与肿瘤微血管面积和患者预后的关系

4．4．1 材料与方法

4．4．2 结果

4．4．3 讨论

4．4．4 小结

第五章 PTN／PTPRZ1介导肿瘤相关巨噬细胞维持胶质瘤干细胞“干性”的分子机制及治疗意义

5．1 肿瘤相关巨噬细胞特异性分泌蛋白PTN的筛选及其在介导肿瘤相关巨噬细胞促瘤效应中的作用

5．1．1 材料与方法

5．1．2 结果

5．1．3 讨论

5．1．4 小结

5．2 PTN／PTPRZ1通路对胶质瘤干细胞“干性”维持和成瘤能力的影响及治疗意义

5．2．1 材料与方法

5．2．2 结果

5．2．3 讨论

5．2．4 小结

5．3 胶质瘤干细胞内PTN／PTPRZ1下游信号通路筛查与鉴定

5．3．1 材料与方法

5．3．2 结果

5．3．3 讨论

5．3．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 miRNA在胶质瘤恶性生物学行为调控中的转化医学价值

文献综述二 miRNA对胶质瘤干细胞的调控作用及机制的研究进展

攻读博士学位期间的研究成果

致谢