Dynamin蛋白在内毛细胞突触囊泡内吞作用及其与听力的关系

摘要

研究背景:
　　目前听力障碍被认为是发达国家最普遍的残疾，而感音神经性耳聋患者占了其中大部分的比例，所以研究感音神经性耳聋的发病机制对疾病的防治至关重要。听觉信号从外周传入听觉中枢需要耳蜗内毛细胞突触释放兴奋性神经递质，引起突触后膜产生动作电位，实现听信号由机械信号-化学信号-电信号的转化，再逐级传入中枢形成听力。内毛细胞突触间神经递质持续、有效的释放需要一个高效的囊泡回收机制。科学研究证明，网格蛋白介导的内吞作用(CME)是囊泡回收的主要途径，对视网膜细胞、神经元细胞的研究发现，Dynamin在内吞过程中发挥着不可或缺的作用。Dynamin的具体作用是其在网格蛋白包裹的内陷囊泡颈部聚集形成螺旋状结构，通过水解GTP调节自身收缩，将囊泡与质膜分离开。研究表明，Dynamin缺失会引起CME功能缺陷，突触囊泡数量减少，导致释放神经递质的能力大大减弱。Dynamin敲除小鼠会出现视力障碍，而对于Dynamin在内耳毛细胞中的分布情况、作用机制及其对听力的影响，目前研究较少。
　　本课题从Dynamin各亚型在内毛细胞的表达定位情况入手，分析Dynamin各亚型在不同年龄小鼠内毛细胞表达模式的差异及其与听力变化的相关性。利用目前检测突触囊泡功能的电生理膜片钳实验，检测Dynamin在内毛细胞中是如何调控突触囊泡内吞作用的，通过以上实验技术，从体内、体外实验，从形态学、分子生物学及生理学等方面了解Dynamin，明确其在内毛细胞网格蛋白介导的内吞过程中的可能作用。
　　实验方法:
　　1、取正常成年昆明小鼠耳蜗基底膜行免疫荧光染色，对Dynamin各亚型在小鼠耳蜗内毛细胞进行初步表达定位，明确Dynamin各亚型在耳蜗内毛细胞中有表达;
　　2、明确蛋白有表达后，分别取出生后2周、10周、16月龄的昆明小鼠，依次分为幼年组、成年组、老年组，测定各组听性脑干反应(ABR)阈值，评估小鼠听力变化;
　　3、采用免疫荧光法观察各年龄阶段小鼠耳蜗内毛细胞Dynamin亚型的表达情况、及细胞形态学变化，探讨蛋白表达情况与年龄及听力的相关性;
　　4、采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同年龄段Dynamin各亚型mRNA表达情况，检测不同年龄对Dynamin表达的影响，进而探讨其与听力的相关性;
　　5、采用全细胞膜片钳技术初步探查阻断Dynamin后内毛细胞膜电容变化情况，了解其在突触囊泡内吞过程中的作用。
　　实验结果:
　　1、正常成年小鼠Dynamin各亚型在耳蜗内毛细胞中均有表达。其中，Dynamin-1表达于整个内毛细胞，Dynamin-2分布在内毛细胞核周围及部分胞质，Dynamin-3散在高表达于内毛细胞核下方靠近螺旋神经节区域。
　　2、各年龄组所测得ABR阈值分析得出，小鼠随年龄增大阈值逐渐增高，成年组与幼年组ABR平均阈值差异无统计学意义，老年组存在明显的听力下降，分别与成年组、幼年组相比听力存在明显差异(P＜0.05)。
　　3、比较不同年龄组Dynamin不同亚型荧光染色图像后发现，幼年组与成年组Dynamin-1、Dynamin-2分布于内细胞质，老年组Dynamin-1在细胞核下部分域存在缺失，Dynamin-2则仅仅表达于内毛细胞核周围。三个年龄组Dynamin-3的定位无差别，均散在定位于内毛细胞核下基底部，靠近螺旋神经节区域，老年组染色较幼年、成年更稀疏、表达更少。
　　4、小同年龄组各亚型mRNA表达水平显示，与幼年组相比，Dynamin-1表达量随年龄增加逐渐减少(P＜0.05)，Dynamin-2在成年表达量至高峰，之后逐渐减少。Dynamin-3的表达情况未能检测出。
　　5、在用Dyngo-4a抑制Dynamin的作用后，采用全细胞膜片钳技术记录耳蜗内毛细胞△Cm增大，由于数据较少，暂不能完成统计学分析。
　　结论:
　　Dynamin各亚型在小鼠内毛细胞均有表达定位，Dynamin-1、Dynamin-2随着年龄的增加表达量有所改变。内耳毛细胞存在网格蛋白介导的内吞作用(CME)，并且Dynamin在其中扮演重要角色。Dynamin的不同亚型在不同年龄阶段对CME交替发挥着作用，即Dynamin-1主要在幼年时期发挥主要作用，到成年阶段Dynamin-2可能取代了Dynamin-1的作用影响着CME过程。由此推测Dynamin-2可能参与整个听力的发展过程，尤其在成年时期，而Dynamin-1对幼年时期的听力起到了一定作用，我们认为Dynamin-3在内毛细胞CME或听力形成中起到的作用尚不明确。全细胞膜片钳技术记录Dynamin的作用被抑制后，囊泡内吞作用无法进行。由此为感音神经性聋的发病机制提供新的研究靶点。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 Dynamin在正常成年小鼠耳蜗内毛细胞表达分布研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 Dynamin在小鼠耳蜗的年龄相关性表达研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 抑制Dynamin后内毛细胞电生理变化初步研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 突触内吞关键蛋白Dynamin的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢