CIK细胞续灌输入治疗在原发性肝癌中应用的临床研究

摘要

研究背景:
　　作为目前全球范围内对人类健康威胁最大的疾病之一，原发性肝癌(Primaryhepatocellular carcinoma，PHC)又被简称为肝癌。其由肝细胞和（或）肝内胆管上皮细胞癌变导致。根据文献报道，每年全世界直接或间接死于原发性肝癌的人数高达60万，而近年来，其也逐渐成为国内死亡率第二的肿瘤性疾病。并且伴随人口老龄化问题的加重，其死亡率仍有进一步上升的趋势。外科手术切除作为当前原发性肝癌的治疗首选方法，在对患者进行严格的手术指征选择的前提下，5年生存率能够达到70％，但由于我国客观条件限制，多数肝癌患者在就诊时已经错过了最佳手术时机，只能选择管肝动脉化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射频消融(Radiofrequency ablation，RFA)、放化疗或肝移植(Liver transplantation operation，LTO)中的一种或几种进行综合治疗，往往不能完全清楚病灶，甚至对患者本身的免疫功能造成影响，治疗效果差强人意。
　　CIK细胞(cytokine induced killer, CIK)作为自体脐血或外周血来源的单个核细胞，是由细胞因子诱导的具有免疫活性的杀伤细胞。其最早在1991年被斯坦福大学的Schmidt-Wolf等人发现并研制。因其是具有CD3+与CD56+双阳性、兼具自然杀伤细胞(nature kill cell，NK)的主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)限制性杀伤与淋巴T细胞的高效杀瘤作用的细胞毒性杀伤细胞，并且体外扩增快，杀瘤效率高，抗瘤谱广泛，毒副作用少，对多重耐药性肿瘤细胞敏感性高，已作为继手术治疗、化学药物治疗、放射治疗之后对原发性肝癌的第4中治疗模式:生物治疗，并成为研究热点。虽然先取患者外周血中的单个核细胞，分离出CIK细胞，在体外进行大量扩增最后重新回输入患者体内以达到杀死原发性肝癌细胞的目的这一方法的疗效已得到广泛认可，并在临床上逐步推广，但对于影响CIK细胞续灌输入治疗原发性肝癌疗效的相关因素尚不清楚，而且缺乏有效的分子靶标以预测治疗效果。
　　研究目的:
　　探讨CIK细胞续灌输入治疗对原发性肝癌患者免疫功能的影响，对防止肝癌术后复发的有效性以及原发性肝癌患者免疫抑制功能与术后复发的相关性进行研究。为进一步提高原发性肝癌患者治疗效果，提高生活质量，改善预后提供依据。
　　研究方法:
　　取重庆市西南医院2012年9月至2014年9月收治的原发性肝癌患者共54例进行研究。分期均为Ⅰ、Ⅱ期，Child-pugh分级均为A、B级。其中男性35例，女性19例，年龄范围44～79岁，并确保54例患者在接受治疗前未使用免疫抑制剂与激素类药物。全部患者根据相应体征、临床症状、B超以及病理学检查明确诊断，并且行外科手术治疗切除肿瘤，清扫淋巴结，病理确认无转移。根据是否接受CIK细胞续灌输入治疗将其分为治疗组（27例）与对照组（27例）。其中治疗组患者术后接受CIK细胞续灌输入治疗2个疗程，对照组患者术后仅接受常规支持治疗。对所有患者进行不少于62周的随访。并分别在治疗前、治疗中以及治疗后随访过程取患者外周血进行淋巴细胞亚群、血浆细胞因子等临床指标进行检测。应用流式细胞仪对所有患者的外周血中细胞骨髓来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、树突状细胞（Dendritic cells，DCs）、调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage，TAM)4类免疫相关细胞进行检测。另选同时期于西南医院体检中心体检的16例资料完整的健康者，取其外周血行免疫相关细胞检测，进行对比分析。统计末次随访时治疗组与对照组患者的复发情况，进行对比，并总结原发性肝癌患者免疫抑制功能与术后复发的相关性。采用SPSS20.0软件包进行统计学分析，计量资料以平均数±标准差((x)±s)表示，使用独立样本t检验进行比较;计数资料以百分比(％)表示，使用卡方检验进行比较。
　　研究结果:
　　CIK细胞在体外诱导培养至14d，其CD3+、CD8+、CD3+CD8+和CD3+CD56+水平均高于诱导前，而CD4+、CD3+CD4+和CD3-CD56+水平则较诱导前低，差异有统计学意义。CIK治疗前，治疗组与对照组的原发性肝癌患者外周血CD3+水平较健康组升高，CD8+水平较健康组降低，CD4+/CD8+则较健康组升高。经过2个疗程CIK治疗后，治疗组CD8+水平升高，CD4+/CD8+则降低，差异有统计学意义。流式细胞分析显示，治疗前，治疗组与对照组原发性肝癌患者外周血MDSCs细胞、Treg细胞、TAM细胞占单核细胞百分比均较健康组升高，DC1/DC2较健康组降低，差异有统计学意义。CIK治疗后，治疗组与对照组患者外周血MDSCs细胞、Treg细胞占单核细胞百分比均较治疗前降低，治疗组TAM细胞占单核细胞百分比较治疗前降低，DC1/DC2升高，差异有统计学意义。治疗后进行组间比较显示，治疗组患者外周血MDSCs细胞、Treg细胞和TAM细胞占单核细胞百分比低于对照组，DC1/DC2高于对照组，差异有统计学意义。治疗组复发率低于对照组(11.1％ vs33.3％，P＜0.05)，治疗组死亡率亦低于对照组，但差异无统计学意义(11.1％ vs18.5％，P＞0.05)。治疗组有5例患者发生低热，自行消退，余无明显不良反应。
　　研究结论:
　　原发性肝癌患者自身免疫环境发生变化，免疫抑制细胞增加，导致机体免疫功能较健康者下降，并与肝癌术后复发相关。而CIK细胞免疫治疗能够显著减少体内免疫抑制细胞含量，改善免疫功能。流式细胞术具有快速、准确、灵敏的优点，通过流式细胞术对原发性肝癌患者治疗前后的免疫功能进行评价，认为CIK细胞在提高患者免疫功能，降低肝癌复发率方面有一定效果，可以改善患者预后，值得临床推广。

目录

声明

缩略语表

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1 临床病例资料

2．2 主要仪器

2．3 主要试剂

2．4 方法

2．5 评价指标

2．6 统计学方法

3．结果

3．1 CIK细胞的形态与表型分析

3．2 不同组CIK治疗前外周血淋巴细胞亚群对比

3．3 外周血MDSCs细胞、DCs细胞、Treg细胞和TAM细胞检测结果

3．4 两组患者接受不同治疗后复发率、死亡率以及不良反应比较

4．讨论

5．结论

全文总结

参考文献

文献综述 CIK生物治疗应用于原发性肝癌的研究进展

在读期间发表的论著

致谢