瞬时感受器电位辣椒素受体4型在大脑皮质发育障碍的作用研究

摘要

癫痫是由多种原因导致的大脑神经元高度同步化异常放电，引起暂时性大脑功能障碍的慢性疾病，是危害我国人民健康的常见病症之一，年发病率为3.5‰～3.7‰。约15％～25％的癫痫患者由于对现有的抗癫痫药物不敏感而发展为难治性癫痫。皮质发育障碍(malformations of cortical development，MCD)是造成难治性癫痫的重要原因之一。新近证据表明，我国接受手术治疗的难治性癫痫患者中，涉及MCD的患者占57.6％;在小于3岁的儿童难治性癫痫患者中，MCD的比例更是高达80％。因此，阐明MCDs发生发展及致痫的分子机制，是提高难治性癫痫临床诊断及疗效的关键。
　　MCD是一组病理学改变相似疾病的总称，在临床实践中可分为较常见的局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia，FCD)，结节性硬化(tuberous sclerosiscomplexes，TSC)，以及相对少见的无脑回畸形，巨脑畸形，灰质异位等。根据国际抗癫痫联盟(International league against epilepsy，ILAE)2011年公布的FCD分型标准，可将FCD分为孤立型病灶和联合型病灶。对于孤立型FCD病灶，依据病理变化特点又分为FCDⅠ型和FCDⅡ型。FCDⅠ型典型的病理表现为皮质板层结构紊乱及微柱样结构的出现。FCDⅡ型除包含皮质板层结构紊乱，进一步出现异形神经元(DNs)和气球样细胞(BCs)，这些异常的细胞统称为异构神经元(MCs)。
　　目前的研究认为，异构神经元可能是胚胎发育过程中端脑室区神经祖细胞的异常迁移，成熟或细胞死亡所致。电生理实验结果提示，异形神经元较正常形态的锥体神经元具有更高的神经兴奋性，可能是病灶内的放电触发器;而气球样细胞并不能产生动作电位，属于放电“沉默”细胞。总之，目前对于异构神经元的发生及其在MCD的具体作用机制仍有待阐明。
　　瞬时感受器电位(Transient receptor potential，TRP)通道是位于细胞或亚细胞膜系统的非选择性阳离子通道蛋白超家族，具有显著的门控特性及特殊的内源性激活机制。目前已发现的TRP家族成员包括TRPV，TRPC，TRPM，TRPA，TRPP和TRPML等6个亚型，共28个离子通道。TRPV通道作为TRP家族的重要成员，不仅对辣椒素敏感，还可以被伤害性温度刺激、细胞外渗透压变化以及内源性脂代谢产物激活。既往的研究发现，TRPV4在中枢神经系统中广泛表达，并参与突触可塑性等生理过程。此外，TRPV4在脑缺血，神经性疼痛及癫痫发作等病理过程中亦发挥重要的作用。癫痫发作过程中，花生四烯酸的脂质代谢产物表达增加，这些脂质代谢产物恰是TRPV4的激动剂。更为重要的是，激活的TRPV4可增强神经系统兴奋性活动，扰乱“兴奋-抑制”平衡。本研究的预实验中，我们在FCDs病灶切除标本中检测到TRPV4表达上调，且特征性的分布于FCDs的异构神经元。因此，TRPV4在MCD的具体表达模式及其在MCD病理发生和癫痫发生过程的作用，引起了我们的强烈关注。
　　为阐明TRPV4在MCDs中的作用及其可能的机制。我们拟通过western blot，免疫组织化学和免疫荧光双标技术观察TRPV4在MCD临床标本中的表达分布;然后，通过培养原代大脑皮层神经元，我们进一步证实TRPV4在皮层神经元内介导钙离子内流活动及其调控通路;最后，为了解TRPV4在癫痫发生的作用，我们建立MCD动物模型及匹鲁卡品癫痫模型，通过检测TRPV4在模型中的表达，并利用膜片钳技术研究TRPV4激活对癫痫发作过程中突触传递的影响。通过这些研究，我们得到以下结果:
　　一、TRPV4在FCDs致痫灶中的表达分布
　　1.我们通过western blot分析，从蛋白水平检测到TRPV4在正常大脑皮层内有表达;免疫组化结果表明TRPV4主要分布于神经元、胶质细胞及血管内皮细胞;
　　2.FCD临床手术标本的组织匀浆中，TRPV4蛋白表达水平较正常对照皮层明显增高，且FCDⅡ型较FCDⅠ型表达显著增高，而在FCDⅡa和FCDⅡb皮质致痫灶中表达无明显差异。免疫组化结果提示，TRPV4在FCDⅠ型微柱样结构，FCDⅡ型异构神经元，以及各型的胶质细胞中均有表达。免疫荧光双标结果发现:①TRPV4与神经元标记物NeuN或NF200共表达于微柱样结构、DNs和BCs;②TRPV4与星形细胞标记物GFAP共表达于胶质细胞及部分BCs，而在微柱样结构和DNs未见共表达;③TRPV4与Glutamate，GABA和GAD67等中间神经元标记物在微柱样结构，DNs和BCs均有共表达。以上结果提示TRPV4在FCDs皮质致痫灶中可能发挥重要作用;
　　3.进一步的研究发现，TRPV4上游的调控信号分子PKC和PKA在FCDⅠa，FCDⅡa和FCDⅡb皮质致痫灶中均有表达，但PKA在FCDs中的表达较正常对照皮层无明显差异，而PKC在FCDs中的表达显著上调，提示FCDs皮质致痫灶内可能是通过PKC而非PKA对TRPV4发挥调控作用。
　　二、TRPV4在TSC皮质结节中的表达分布
　　1.本部分研究，我们收集TSC皮质结节及结节周围的手术切除标本，从蛋白水平证实TRPV4在TSC皮质结节中的表达相对于结节周围及正常对照皮质显著增加，提示TRPV4的高表达可能与TSC皮质结节的发生发展有关;
　　2.免疫组化和免疫荧光双标的研究结果显示，TRPV4在TSC皮质结节中的DNs，GCs和星形胶质细胞中有表达，且TRPV4与NF200，Glutamate和GABA共表达于DNs和GCs，未见TRPV4与GFAP共表达于DNs和GCs。
　　3.TRPV4的上游调控信号PKC和PKA在DNs和GCs均有表达，但PKC在TSC结节较结节周围组织和正常对照组织中的表达显著上调，而PKA的表达在TSC及正常对照组织中无明显差异。
　　三、TRPV4对皮层神经元钙离子的调控作用
　　1.我们通过培养原代脑皮层神经元，利用激光共聚焦钙成像技术，结合TRPV4激动剂与抑制剂，在胞内钙离子荧光探针Fluo-3的作用下，研究TRPV4激活对神经元胞内钙离子浓度变化的调控;
　　2.采用4αPDD激活TRPV4后发现，胞内钙离子浓度增加与TRPV4激活程度呈现量效关系，且TRPV4是通过引入胞外钙离子内流而引起胞内钙离子浓度的迅速增高;
　　3.采用PKC和PKA通路激动剂与抑制剂发现，PKC通路是调控TRPV4影响胞内钙离子浓度增高的上游调控分子，而PKA通路则不具有类似效应。
　　四、TRPV4在MCD癫痫发生中的作用
　　1.我们通过腹腔内注射亚甲基偶氮甲醇构建MCD大鼠模型，western blot检测发现TRPV4的表达在MCD模型与正常对照之间无显著差异，这提示TRPV4可能未参与MCD病理发生;
　　2.然后，我们通过匹鲁卡品腹腔注射构建癫痫小鼠模型。Western blot，免疫组化和免疫荧光结果发现，TRPV4在癫痫模型中的表达显著上调，提示TRPV4与癫痫发作存在紧密联系。
　　3.最后，我们利用癫痫小鼠模型脑片进行膜片钳实验。结合TRPV4激动剂4αPPD与抑制剂HC067047，我们发现癫痫小鼠模型中，TRPV4激活后能显著提升兴奋性突触后电流的发放频率，提示TRPV4通过增强兴奋性突触传递推动癫痫的发生发展。
　　综上所述，本研究结果表明:
　　1.TRPV4及其上游信号调控分子PKC在MCD临床标本中表达显著增加，主要分布于反应性胶质细胞及异构神经元;
　　2.大脑皮层神经元可通过TRPV4调节钙离子向细胞内流动，PKC而非PKA是调控这一功能的信号分子;
　　3.与正常对照动物相比，TRPV4在MCD动物模型的表达无明显差异，但是在癫痫动物模型中表达显著上调。激活TRPV4可以增加癫痫动物模型mEPSC和sEPSC的发放频率;
　　4.以上结果有力提示，TRPV4可能参与MCD的癫痫发生过程。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 TRPV4在MCD中的表达与分布

2．1 TRPV4在FCDs致痫灶中的表达分布

2．1．1 材料和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

2．2 TRPV4在TSC皮质结节中的表达分布

2．2．1 材料和方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．2．4 小结

第三章 TRPV4对皮层神经元钙离子的调控作用

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 TRPV4在MCD癫痫发生中的作用研究

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 癫痫发作的离子动力学改变

学习期间发表和待发表的论文

致谢