抗糖尿病药物中激活Nrf2通路的抗氧化剂对肿瘤转移的影响及机制研究

摘要

流行病学调查显示，糖尿病患者中某些肿瘤发生率增高，2010年美国糖尿病协会和美国癌症协会的共识报告显示2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)患者罹患结肠直肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌等的风险增加;且其相关性在近期发表于British Medical Journal的meta分析中得到了证实。随着糖尿病患病率的增加，糖尿病合并肿瘤患者群也日益增多。对于糖尿病合并肿瘤这一特殊人群也需采取相应的降糖措施，但降糖治疗对肿瘤生物学行为影响的具体机制尚不明确。
　　二肽基肽酶Ⅳ抑制剂(DPP-4i)是临床常用的降糖药物，且被美国临床内分泌学会(AACE)糖尿病综合管理指南推荐DPP-4i作为二甲双胍之外的一线药物选择。我们前期的meta分析提示，DPP-4i并不增加新生肿瘤发生风险，故其对单纯的糖尿病患者是适用的;其在糖尿病合并肿瘤患者中的应用是否安全及其具体的影响机制尚需进一步研究证实。
　　α-硫辛酸(alpha lipoic acid, ALA)由于其能够增加内源性抗氧化剂及Ⅱ相解毒酶的水平，具有保护细胞免受氧化应激损伤的作用。因此ALA常被作为抗氧化剂用于预防糖尿病、高血压等疾病对机体的氧化应激损伤;同时也被推荐作为抗肿瘤药物。ALA的抗肿瘤作用主要表现为抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡;而对于肿瘤转移的影响目前尚未得到研究者们的太多关注。
　　目的：
　　本研究拟通过离体肿瘤模型观察DPP-4i、ALA对肿瘤细胞迁移、侵袭行为的影响;通过建立肝癌、结肠癌转移模型裸小鼠，观察DPP-4i、ALA对体内肿瘤转移的影响。并利用离体及在体肿瘤模型，结合基因沉默或过表达/药理激活Nrf2等技术，阐明DPP-4i、ALA促肿瘤转移的可能分子生物学机制。旨在明确DPP-4i与肿瘤生物学行为关联，解析其可能的分子信号级联机制，探索糖尿病合并肿瘤的合理用药原则。
　　方法：
　　1.离体实验
　　1.1 DPP-4i对肿瘤细胞的效应观察:沙格列汀(Saxagliptin，0.1μM)、西格列汀(Sitagliptin，0.6μM)处理肿瘤细胞;(1)Transwell、Transwell+基质胶实验检测细胞迁移、侵袭能力;(2)活细胞工作站系统观察细胞的定向迁移性，采用Image J分析细胞的定向性(persistence)及迁移指数（forward migrate index，FMI）。
　　1.2 DPP-4i对DPP-4酶活性、氧化应激及Nrf2途径的影响:(1)ELISA试剂盒检测DPP-4酶活性变化;(2)氧化应激检测:DCFH-DA探针ROS检测;GSH/GSSG检测:参照试剂盒说明书进行（GSH and GSSG Assay Kit，碧云天），酶标仪A412测吸光度;8-oxo-dG检测:细胞预处理后多聚甲醛固定，荧光间接染色法标记8-oxo-dG（Abcam）;(3) Nrf2与Ⅱ相解毒酶表达检测:qRT-PCR检测基因转录、免疫组化、Western Blot检测蛋白表达;(4)泛素化实验分析Keap1-C151S对Sax诱导Nrf2激活的影响。
　　1.3 Western Blot检测肿瘤转移相关蛋白表达，包括:(1)转移相关蛋白:HIF-1、VEGF、Cox-2;(2)淋巴转移（结肠癌）相关蛋白:APRIL、BABMI;(3)血行转移（肝癌）相关蛋白:Cortactin。
　　1.4 基因沉默、过表达/药理(ALA、莱菔硫烷(sulforaphane，SF))激活Nrf2对肿瘤细胞相关表型的影响:(1)Transwell、Transwell+基质胶实验检测细胞迁移、侵袭能力;(2)活细胞工作站系统观察细胞的定向迁移性，分析细胞的定向性(persistence)及迁移指数(FMI)。
　　1.5 基因沉默、过表达/药理(ALA、SF)激活Nrf2对肿瘤转移相关蛋白表达的影响:免疫组化、Western Blot检测相关蛋白表达，包括:HIF-1、VEGF、Cox-2 APRIL、BABMI、Cortactin等。
　　2.在体实验
　　2.1 DPP-4i对肿瘤转移作用的体内研究:(1)雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周时，分别通过尾静脉、爪垫注射HuH-7-Luc+、HCT116-Luc+细胞建立肝癌、结肠癌转移模型。两类模型均分为对照组、沙格列汀组(15mg/kg)、西格列汀组(120mg/kg)，三组分别以灌胃的方式、每日1次给予安慰剂、沙格列汀、西格列汀0.2ml，干预6周。(2)小动物活体成像观察体内肿瘤形成及转移情况;(3) HE染色观察肝脏、肺等器官肿瘤转移的组织形态学变化;(4)免疫组化、Westem Blot检测肝、肺等组织Nrf2及其下游相关基因、肿瘤转移相关蛋白表达。
　　2.2 基因沉默Nrf2对肿瘤转移作用的体内研究:雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周时，尾静脉注射HuH-7-Luc+细胞建立肝癌转移模型。(1)随机分为对照组、Nrf2 shRNA组，喂养3周，小动物活体成像观察体内肿瘤转移情况;(2)对照组、Nrf2 shRNA组内分别再分为Sax组(Sax15 mg/kg)、Sit组(Sit120 mg/kg)，药物以灌胃的方式给予（药物体积:0.2ml），干预3周。观察指标同2.1。
　　2.3 ALA、SF对肿瘤转移作用的体内研究:雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠8周时，尾静脉注射HuH-7-Luc+细胞建立肝癌转移模型。随机分为对照组、ALA组(80 mg/kg)或对照组、SF组(10 mg/kg)，均以腹腔注射的方式给药（药物体积均为:0.2ml），干预3周。观察指标同2.1。
　　3.人肝癌组织芯片免疫组化染色:对195例肝癌组织芯片（105例未转移肝癌、69例发生淋巴转移肝癌、2例发生远处转移肝癌、19例肝癌转移病灶）免疫组化染色结果进行评分，分析Nrf2、GCLM的蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.1 DPP-4i对肿瘤细胞的效应观察:(1)Transwell、Transwell+基质胶实验、活细胞工作站的结果提示Sax、Sit作用的肿瘤细胞的迁移、侵袭能力增加，且肿瘤细胞的定向迁移能力显著增加（persistence提高、FMI增加）。(2) Western Blot分析，Sax、Sit干预后肿瘤细胞的转移相关蛋白表达增加。
　　1.2 小动物活体成像结果显示:Sax、Sit干预6周的肝癌、结肠癌肿瘤转移模型裸小鼠体内肿瘤转移明显增加;体重明显减低;免疫组化及Western Blot结果显示:DPP-4i干预的肝脏、肺组织中转移相关蛋白的表达水平升高。
　　1.3 氧化应激检测结果表明:DPP-4i显著降低肿瘤细胞内的ROS、8-oxo-dG水平，增加GSH/GSSG比例，提示:DPP-4i促肿瘤转移可能与氧化应激水平降低有关。
　　1.4 DPP-4i干预的肿瘤细胞及肿瘤模型肝脏、肺组织的Nrf2及其下游相关基因的蛋白表达水平显著增加，提示:DPP-4i促肿瘤转移可能与Nrf2上调有关;泛素化实验结果提示，DPP-4i对Nrf2的激活可能与其抑制Keap1-C151S对Nrf2的降解实现的。
　　1.5 基因沉默Nrf2能够显著改善自发及DPP-4i诱导的肿瘤细胞及肝癌转移模型裸小鼠体内肿瘤的转移。
　　1.6 过表达/药理(ALA、SF)激活Nrf2，肿瘤细胞及肝癌转移模型裸小鼠体内肿瘤转移显著增加。
　　1.7 对195例人肝癌组织芯片免疫组化染色结果进行分析，发现Nrf2、GCLM的蛋白表达与肿瘤的转移、分期密切相关。
　　结论：
　　我们的研究结果表明，治疗糖尿病药物DPP-4i和ALA能够通过抑制肿瘤中的Keap1-C151S泛素化进而激活Nrf2，从而促进肿瘤的迁移与侵袭。而且，人组织芯片结果分析表明Nrf2的蛋白表达水平与肿瘤的转移密切相关，提示其可作为潜在的肿瘤生物进展标志物及分子治疗靶点。我们的研究结果进一步提示，激活Nrf2的抗氧化剂在肿瘤患者中的运用应当慎重。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 降糖药物DPP-4i促进肿瘤迁移／侵袭的体内外实验研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 DPP-4i激活Nrf2通路促肿瘤转移的机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 基因沉默／激活Nrf2对肿瘤转移的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

第五章 Nrf2及下游相关蛋白在肝癌组织中的表达及意义

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 糖尿病、降糖治疗与肿瘤生物学进展

攻读博士学位期间发表的文章

致谢