CIK细胞联合表达白介素12的溶瘤腺病毒治疗肝癌的疗效及机制研究

摘要

本文从以下两部分进行论述：
　　第一部分:研究表达IL-12的双靶向溶瘤腺病毒联合CIK细胞对肝癌的治疗效果
　　目的:
　　探讨CIK细胞联合表达IL-12的溶瘤腺病毒的体内外抗肿瘤作用，分析其联合抗肿瘤作用的机制，为“细胞-病毒-基因”联合疗法提供实验基础。
　　方法:
　　利用细菌重组技术，在课题组双靶向性溶瘤病毒AdCN205系统的基础上构建表达IL-12基因的肿瘤特异性溶瘤病毒AdCN205-IL12;通过检测溶瘤病毒AdCN205-IL12在BEL7404、HuH-7、SMMC7721等肿瘤细胞系和正常肝细胞AKN-1中的病毒复制能力，IL-12基因表达水平，来验证其肿瘤特异性;通过对比溶瘤病毒AdCN205-IL12对肿瘤细胞BEL7404、HuH-7、Hep3B和正常肝细胞AKN-1的体外杀伤作用，来验证其肿瘤靶向杀伤能力;通过表达荧光素酶的慢病毒载体pCDH-EF1α-Luciferase-2A-mCherry构建稳定表达Luciferase的靶细胞系，检测CIK与溶瘤病毒联合杀伤后靶细胞系HuH-7和Hep3B中残余Luciferase的酶活性，替代Cr51同位素释放试验来研究CIK细胞联合溶瘤病毒的体外杀伤效果;通过免疫组化标记人CD3分子研究CIK细胞浸润肿瘤组织的情况，通过免疫组化标记CD34分子研究肿瘤血管密度，研究CIK联合表达IL-12的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用机制。
　　结果:
　　通过对体外培养14天的CIK细胞进行检测，结果显示CD3阳性的T细胞占总细胞群体的94.05％±6.74％，CD3/CD4双阳性的Th细胞占总细胞群体的12.13±1.58％，CD3/CD8阳性的CTL细胞占总细胞群体的69.2％±4.75％，CD3/CD56双阳性的NKT细胞占总细胞群体的25.48±4.77％，CD3-/CD56+的NK细胞占总细胞的5.33％±4.32％，共有83.5±3.87％的细胞表达与肿瘤非特异杀伤相关的NKG2D分子。此结果与以往的报道的CIK细胞表型一致。AdCN205-IL12和AdCN205-GFP对肿瘤细胞具有较强的杀伤能力，但两者之间无差异。说明IL-12基因不能提高溶瘤病毒的体外杀伤作用能力。表达IL-12的非复制型病毒AdIL-12体外对肿瘤细胞也无杀伤作用。说明单纯的IL-12对肿瘤细胞无直接杀伤效果。在效靶20∶1的情况下，IL-12提升CIK细胞的体外抗肿瘤作用，由14.37％±2.24％提升至34.68％±1.78％，P=0.000553，在40∶1的情况下抗肿瘤作用由51.50％±1.19％提升至70.23％±0.96％，p=0.001979，提示IL-12可以显著提升CIK细胞对肝癌细胞的抑制作用;在效靶比10∶1，病毒感染系数为10MOI的情况下，对于肝癌细胞系HuH-7，在48h的时间点，CIK细胞联合AdCN205-GFP组较单CIK组，肿瘤细胞存活率降低，差异显著(n=3，p=0.0260)，CIK细胞联合AdCN205-IL12组较单CIK组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著(n=3，p=0.0018);72h的时间点CIK联合AdCN205-IL12组较联合AdCN205-GFP组的肿瘤抑制作用更强，差异显著(n=3，p=0.0135);在效靶比10∶1，病毒感染系数为10MOI的情况下，对于肝癌细胞系Hep3B，CIK细胞联合AdCN205-IL12组较单CIK组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著(p=0.0001)，较单独AdCN205-GFP组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著(p=0.00026)，较单独AdCN205-IL12组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著(p=0.00032)，较CIK联合AdCN205-GFP组肿瘤细胞存活率降低，差异极显著(p=0.00027)。在72h的时间点，CIK细胞联合AdCN205-IL12病毒组较其他各组均有极显著的抑制效果(P＜0.001)。提示CIK细胞联合溶瘤病毒可提升对肿瘤细胞的抑制作用，表达IL-12基因可进一步提升抗肿瘤效果。体内移植瘤模型治疗结果显示，单一治疗组(AdCN205-GFP，AdCN205-IL12，CIK)相对PBS组而言具有一定的肿瘤抑制效果，且差异极显著(n=8，p＜0.001)，但是单一治疗组之间并无显著差异。CIK细胞联合AdCN205-GFP组较单一治疗组AdCN205-GFP(n=8，p=0.02)和CIK(n=8，p=0.008)具有显著差异。 CIK细胞联合AdCN205-IL12组具有最强的抗肿瘤作用，其较所有单一治疗组具有极显著差异(n=8，p＜0.001)，较CIK联合AdCN205-GFP组抗肿瘤效果更显著(n=8，p=0.047)。治疗过程中发现，CIK细胞联合AdCN205-IL12组中有2只小鼠肿瘤完全消失。在小鼠生存时间上，PBS组与其它各治疗组间均有统计学差异。但各治疗组间差异不显著。体内移植瘤模型治疗结果显示，CIK联合AdCN205-IL12组，CIK联合AdCN205-GFP组，及单AdCN205-GFP组的瘤组织出现大量坏死，而PBS组，CIK组及AdCN205-IL2组坏死区域相对较少;CIK联合AdCN205-IL12组浸润的人源CD3阳性的细胞数显著高于其他组。说明IL-12可增强CIK细胞的浸润或促进CIK细胞在肿瘤细胞内的增殖或存活;GFP或IL-12仅在肿瘤组织有表达，而在肝脏组织中未检测到GFP或IL-12的表达，提升CIK联合溶瘤病毒治疗不影响外源基因在组织中表达的特异性。免疫组化的结果显示病毒仅在肿瘤细胞中能够检测出来，而在正常肝脏中检测不到病毒Hexon的存在，提示CIK联合病毒治疗不影响病毒复制的特异性。
　　结论:
　　CIK细胞联合表达IL-12基因的双靶向性溶瘤病毒AdCN205-IL12具有协同抗肿瘤作用，发现溶瘤病毒的肿瘤裂解作用和肿瘤局部高浓度IL-12的表达增加了CIK细胞在肿瘤组织内的浸润数量，增强了CIK细胞的抗肿瘤作用，实现了“细胞-病毒-基因”强强联合的治疗效果。
　　第二部分:CIK细胞运载Ad5/11嵌合型病毒靶向肝癌治疗的机制研究
　　目的:
　　针对肝癌弥撒生长或广泛转移的特性，探讨CIK细胞运载Ad5/11嵌合型病毒实现血液系统给药的可行性，并研究病毒转载及转移的相关机制。
　　方法:
　　流式细胞技术检测CIK细胞表面CAR、αvβ5、αvβ3、CD46分子的表达情况;通过Ad5-CMV-GFP病毒感染CIK细胞，并检测细胞GFP阳性率研究5型病毒对CIK细胞的感染情况;通过Ad5-CMV-GFP-11F嵌合病毒感染CIK细胞检测细胞GFP阳性率研究Ad5/11型病毒对CIK细胞的感染能力;通过Texsa Red标记病毒于激光共聚焦显微镜下观察病毒结合CIK细胞的能力;通过Texas Red标记病毒，FITC标记CD46分子，研究病毒感染CIK细胞的过程与CD46分子的相关性;通过体外模拟CIK细胞在血液运输过程中受到的剪切作用，病毒感染CIK细胞后，通过10倍体积的PBS洗涤，再将洗涤后的CIK细胞与肿瘤细胞共培养，观察病毒转移情况;通过CIK细胞携带AdCN205系统的溶瘤腺病毒，研究经CIK细胞携带的病毒是否保持感染、增殖和基因表达活力，以及体外抗肿瘤能力;体外检测CIK携带溶瘤病毒对肝癌HuH-7细胞和PLC/RPF/5细胞的杀伤作用;通过DiO标记CIK细胞膜，Texsa Red标记病毒于激光共聚焦显微镜下观察病毒由CIK细胞转移至肿瘤细胞的过程;研究病毒转移过程与细胞膜的相关作用的关系;通过细胞松弛素D抑制细胞骨架运动，研究病毒转移过程与病毒骨架的运动的相关性;
　　结果:
　　CIK细胞表面不表达CAR、αvβ5、αvβ3等与5型腺病毒感染相关的受体分子，而大量表达与11型腺病毒感染细胞相关的补体调节分子CD46受体;且5型腺病毒无法感染和吸附CIK细胞;Ad5/11嵌合型腺病毒可吸附于CIK细胞表面，在100MOI感染系数下对CIK细胞的感染效率可达到45.2±3.4％; Ad5/11嵌合型腺病毒可感染上皮来源的肿瘤细胞，感染效率与Ad5型病毒无差异;Ad5/11嵌合型腺病毒可在细胞表面引起极化作用，但病毒进入CIK细胞的能力有限;装载Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK细胞与肿瘤细胞共培养后，病毒可由CIK细胞表面转移至肿瘤细胞;CIK可携带Ad5/11嵌合型瘤腺病毒并将病毒转移至肿瘤细胞，并保持溶瘤病毒的杀伤活性，对于HuH-7细胞，72h时CIK细胞携带AdCN205-GFP-11F组肿瘤细胞存活率显著低于单CIK组(p=0.0008)，和CIK携带AdCN205-GFP组(p=0.0168);对于PLC/RPF/5细胞，72h时CIK细胞携带AdCN205-GFP-11F组PLC/PRF/5细胞存活率显著低于单CIK组(p＜0.0001)，和CIK携带AdCN205-GFP组(p=0.005);Ad5/11嵌合型腺病毒由CIK细胞表面转移至肿瘤细胞依赖于CIK细胞与肿瘤细胞间膜的相互作用;通过细胞松弛素D抑制细胞骨架的运动可抑制病毒的转移过程;
　　结论:
　　Ad5/11嵌合型腺病毒可感染和吸附CIK细胞，携带Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK细胞通过CIK细胞与肿瘤细胞膜之间的相互作用将病毒转移至肿瘤细胞中，并保持病毒的生物学活性。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景

1．2 研究意义

1．3 研究内容及方法

第二章 表达IL-12的溶瘤腺病毒协同CIK细胞的抗肿瘤作用及机制研究

2．1 实验材料

2．2 试验方法

2．3 结果

2．4 小结

2．5 讨论

第三章 CIK细胞运载Ad5／11嵌合型病毒靶向肿瘤治疗的机制研究

3．1 实验材料

3．2 试验方法

3．3 结果

3．4 小结

3．5 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 基因疗法与过继免疫疗法在肿瘤治疗中的应用

攻读学位期间的研究成果

致谢