膳食因子咖啡因和薄荷醇调控血压的机制研究

摘要

背景和目的:
　　高血压是全球重大可控性慢性疾病，已成为脑卒中、冠心病和心肾功能衰竭等的主要原因，其发病率呈逐年上升趋势。在高血压的发病机制中，环境因素所起的作用约占60％。流行病学研究证实50％的高血压为盐敏感性高血压，而寒冷也是导致高血压的重要环境因素。很多食物中的天然成分，如咖啡因和薄荷醇具有调控血压的作用。因此，探索膳食因子调控血压的作用及分子机制对高血压及心血管疾病的防治有重要的意义。
　　咖啡因是常用的精神活性物质，具有利尿和利钠的作用。然而，由于咖啡因有激活交感神经的作用，急性摄入咖啡因可升高血压。近期研究发现，慢性摄入咖啡因可以改善代谢综合征，并有降低血压的作用，但其机制还不清楚。钠盐摄入过多是导致原发性高血压发生、发展的重要环境因素，肾集合管上皮钠通道(Epithelial sodiumchannel，ENaC)在钠的重吸收和血压调节中起着关键作用。研究报道咖啡因能够影响细胞中一些调控ENaC的激酶的活性，但咖啡因是否作用于这些激酶从而调节ENaC的表达和钠的重吸收功能尚不清楚，咖啡因对肾脏钠重吸收和血压的长期效应亦鲜有报道。
　　薄荷醇为薄荷和薄荷精油中的主要成分，近年研究发现薄荷醇可激活感受寒冷的瞬时受体电位通道M8亚型(Transient receptor potential melastatin8，TRPM8)。TRPM8属于非选择性阳离子通道，能介导Ca2+、Na+、K+等阳离子内流。研究证实，TRPM8除在神经末梢表达，在血管平滑肌也有表达。薄荷醇激活TRPM8使平滑肌细胞内钙信号增加，但尚不清楚薄荷醇调控血管收缩和舒张的分子机制。研究发现TRPM8对平滑肌细胞Ca2+内流和肌浆网Ca2+释放均有调节作用。因此，我们推测薄荷醇可能通过激活血管平滑肌TRPM8影响细胞内Ca2+变化及相关信号通路，抑制血管收缩，降低血压。
　　为了验证上述推测，本研究分为两部分进行。第一部分为咖啡因对血压的调控，观察长期摄入咖啡因对高盐饮食的Dahl's盐敏感大鼠血压的影响，从细胞和分子水平阐明慢性咖啡因干预调节血压的机制，并观察摄入咖啡因对健康人血压和尿电解质的影响。第二部分为薄荷醇对血压的调控，探讨薄荷醇激活TRPM8对血管收缩、舒张功能的调节，及其具体的分子机制。
　　材料方法:
　　整个研究包括离体实验和在体实验。咖啡因对血压的调控使用Dahl's盐敏感性高血压大鼠和肾集合管细胞M1CCD作为研究对象。薄荷醇对血压的调控使用TRPM8-/-小鼠和同窝野生对照小鼠的肠系膜动脉和培养的血管平滑肌细胞VSMCs作为研究对象。
　　1.持续监控高盐饲料（对照组）和高盐饲料+含0.1％咖啡因的水（咖啡因组）Dahl's盐敏感性高血压大鼠的血压和活动度，每日测量饮水、进食、体重。干预第15天结束时收集大鼠大便和24小时尿液检测电解质成分。大鼠腹腔注射ENaC特异性抑制剂阿米洛利后再次收集尿液测量尿电解质成分，计算对照组和咖啡因组经ENaC重吸收钠的含量。
　　2.小动物超声测量大鼠心脏结构和功能。大鼠处死后测量肠系膜动脉内皮依赖和内皮非依赖的舒张功能和电场刺激（Electrical field stimulation，EFS）介导的血管收缩功能，Ussing Chamber观察咖啡因对小肠上皮电解质转运的影响。
　　3.Western blot检测大鼠肾脏皮质集合管ENaC的表达和调控ENaC相关激酶的表达情况及在调控ENaC中的作用，并在体外观察咖啡因对ENaC通道活性的影响。
　　4.测量健康志愿者饮用咖啡对24小时尿电解质和动态血压的影响。
　　5.Western blot检测薄荷醇激活TRPM8-/-对血管平滑肌细胞RhoA/ROCK信号通路的影响。观察薄荷醇对离体血管瞬时收缩成分和强直收缩成分的影响，并观察去除血管内皮对薄荷醇舒张血管作用的影响。
　　结果:
　　1.咖啡因干预组大鼠的收缩压和平均动脉压显著低于对照组大鼠，慢性咖啡因干预对大鼠活动度、心率、心脏结构、血浆儿茶酚胺及血管收缩和舒张功能均无影响。
　　2.咖啡因干预显著增加Dahl's盐敏感大鼠24h尿钠浓度及24h钠排出总量。
　　3.使用ENaC特异性抑制剂阿米洛利后，咖啡因组增加的钠排出量显著低于对照组。而使用肾小管钠/氯共转运体(NCC)抑制剂氢氯噻嗪后，两组增加的钠排出量无显著性差异。
　　4.咖啡因干预能显著降低皮质集合管αENaC表达，而βENaC、γENaC和NCC表达无显著性变化。
　　5.咖啡因干预降低肠道钠氢共转运体(NHE)介导的钠水吸收，轻微增加粪便钠排出。
　　6.咖啡因能显著增加小鼠肠粘膜上皮的短路电流(Isc)，抑制cAMP的产生可抑制咖啡因介导的Isc升高。阻断肌浆网ryanodine受体和钙激活的钾通道可降低咖啡因介导的Isc升高。
　　7.咖啡因干预皮质集合管细胞(M1CCD)可上调AMPKα表达及其磷酸化水平，抑制αENaC表达，并降低其开放概率。
　　8.健康志愿者喝普通咖啡15天后24小时尿量和尿钠排出量显著高于基线水平，收缩压和舒张压较对照组轻微降低。
　　9.薄荷醇激活TRPM8可抑制U46619介导的小鼠肠系膜动脉的血管收缩。
　　10.薄荷醇对血管瞬时收缩和强直收缩成分均有抑制作用，但对强直收缩成分的抑制作用更强。薄荷醇对强直收缩成分的抑制作用与肌浆网钙泵抑制剂和ROCK-2抑制剂Y27632类似。
　　11.当血管处于舒张状态时，薄荷醇浓度依赖的引起血管收缩，但血管收缩的幅度很小。薄荷醇的舒血管作用是内皮非依赖性的。
　　结论:
　　1.慢性摄入咖啡因能减轻高盐引起的盐敏感大鼠血压升高，与咖啡因增加盐敏感大鼠尿钠排出有关。
　　2.咖啡因激活肾皮质集合管细胞AMPK降低αENaC表达，从而减少经ENaC重吸收的钠离子。
　　3.慢性摄入咖啡因增加健康人尿钠排出，轻微降低受试者血压。
　　4.薄荷醇通过抑制平滑肌细胞肌浆网钙释放和RhoA信号通路抑制血管收缩。薄荷醇的血管舒张作用是内皮非依赖性的。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 咖啡因促进尿钠排泄调控血压的机制

2．1 咖啡因对盐敏感大鼠血压、尿钠和肠道氯化钠吸收的作用

2．1．1 材料和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

2．2 咖啡因增加盐敏感大鼠尿钠排出和减少小肠钠吸收的分子机制

2．2．1 材料和方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

2．2．4 小结

2．3 咖啡对健康志愿者尿钠排出和血压的影响

2．3．1 材料和方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

2．3．4 小结

第三章 薄荷醇激活TRPM8对血管功能的调控

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述

攻读博士学位期间发表的论文

致谢