外周Aβ和系统疾病在阿尔茨海默病发生中的作用及机制研究

摘要

背景和目的：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病，以进行性记忆下降和认知功能减退为主要临床表现。AD的发病机制复杂，尚未完全阐明。脑实质和脑血管壁的β-淀粉样肽(Amyloid-beta，Aβ)沉积是AD的主要病理特点。根据Aβ级联假说，AD是脑内Aβ的过度产生或清除障碍，Aβ在脑内过度集聚和沉积后通过诱发炎症、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、神经变性和死亡而导致痴呆。Aβ是由其前体蛋白（Amyloid-beta precussor protein，AβPP）经酶切产生。AβPP主要表达于脑神经元，但是，全身其它多种组织也同样表达AβPP且可生成Aβ，比如血液、皮肤、骨骼肌等。而且，外周Aβ可跨过血脑屏障进入脑组织。目前认为脑内Aβ沉积来自脑组织自身产生的Aβ，而外周来源的Aβ对脑内β淀粉样变的影响并不清楚，值得研究。传统观点认为AD是大脑本身的疾病。周围系统疾病在AD发生发展中的作用尚不清楚。本课题对外周来源的Aβ和系统疾病在AD发生中的作用及机制进行初步探索，以从全身角度理解AD的发病机制。
　　材料和方法：
　　研究一、外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用
　　1.构建并联小鼠模型。本课题采用的雌性C57野生型小鼠（Wt小鼠）来自第三军医大学动物实验室，APPswe/PS1 dE9转基因小鼠（Tg小鼠）来自美国Jackson实验室。并联的Wt小鼠和AD小鼠要求性别和年龄匹配。在并联手术前1月即9月龄时将Wt和AD小鼠配对并同龄饲养，使之相互适应，10月龄时做并联手术，分别并联至12月龄、14月龄、18月龄和22月龄，以未并联同龄Wt小鼠作为对照（每组n=6）。采取皮肤缝合的并联手术方法。
　　2.取材。6％水合氯醛将小鼠麻醉后处死，右心房取血后，生理盐水灌注，取脑并称重。右侧半球置于4％多聚甲醛中固定，用作组织染色;左侧半球冻存于-80℃冰箱，用作生化分析。
　　3.AD类型病理改变的组织染色。6E10、4G8、刚果红和硫磺素S染色检测Aβ斑块和脑淀粉样血管病（Cerebral amyloid agiopathy，CAA）。A11、6E10分别与DAPI共染检测神经细胞内Aβ。pS396染色检测Tau磷酸化水平。6E10与CD45或者GFAP共染检测神经炎症。神经营养因子受体p75NTR和神经纤维NF200染色检测神经变性。普鲁士蓝染色检测脑微出血。
　　4.ELISA检测。将脑组织加入RIPA裂解液裂解。10级强度超声处理40秒后，100，000×g4℃离心1小时，取上清液，为可溶性提取物。管底组织继续加入200μl70％ FA液，10级强度超声处理30秒后，100，000×g4℃离心1小时，取上清液，为FA提取物。采用ELISA试剂盒检测小鼠外周血以及RIPA和FA提取物中的Aβ40和Aβ42水平。脑匀浆中炎症因子如TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平也用ELISA方法检测。
　　5.免疫印迹。取适量脑粉加入RIPA裂解液溶解后超声处理，10，000g4℃离心60分钟。BCA法测定总蛋白浓度。配制电泳胶做免疫印迹，一抗为抗Aβ、PSD93、PSD95、VAMP1、synaptophysin、pS199、pS396、LRP1和RAGE抗体，二抗为抗Actin抗体。
　　研究二、常见病原体慢性感染与AD的相关性研究
　　随机纳入2012年至2014年在大坪医院就诊的128例散发性AD患者，同时在本院健康体检中心随机抽取135例性别和年龄匹配的正常对照。采用酶联免疫方法定量检测人血液中抗巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，单纯疱疹病毒1型(Herpes simplexvirus type-1，HSV-1)，肺炎衣原体（Chlamydophila pneumoniae，C.pneumonia），幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hpylori以及伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi，B.burgdorferi)的IgG型抗体水平，确定机体感染情况。以同一患者血清中常见病原体抗体阳性数的总和作为感染负荷(Infectious burden，IB)。检测血清Aβ40、Aβ42、TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平。分析感染负荷和AD的相关性，以及具有不同感染负荷的AD患者的血清Aβ和炎症因子水平差异。
　　研究三、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究
　　随机纳入自2014年9月至12月在大坪医院睡眠中心就诊的94例可疑阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）患者。其中45例最终确诊为OSAS，剩下的49例单纯鼾症患者作为对照。纳入本研究的所有患者的MMSE评分均在正常范围内，表明其认知功能正常。检测血清Aβ40、Aβ42、总tau(T-tau)和磷酸化tau181(P-tau181)水平。分析Aβ和呼吸暂停低通气指数(Apnea hypopnea index，AHI)、血氧饱和度下降指数(3％ oxygen desaturation index，ODI)、最低血氧饱和度值(Lowest SaO2)和平均血氧饱和度值(Mean SaO2)的相关性。
　　研究四、慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究
　　随机纳入2014年至2015年在大坪医院呼吸科就诊的77例散发性慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者，同时随机抽取45例性别和年龄匹配的正常对照。纳入本研究的所有COPD患者的MMSE评分均在正常范围内，表明其认知功能正常。检测血清Aβ40、Aβ42、IL-6、降钙素原(procalcitonin，PCT)和C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平。分析Aβ水平与炎症和肺功能的相关性。
　　结果：
　　研究一、外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用
　　1.并联Wt小鼠的脑Aβ含量随并联时间延长而增加。12月龄、14月龄、18月龄以及22月龄并联Wt小鼠的外周血Aβ水平显著增高，与并联Tg小鼠外周血Aβ水平无显著性差异，表明Tg小鼠外周血Aβ进入并联Wt小鼠的血液循环系统，证明该并联模型构建成功。免疫印迹和ELISA方法检测不同并联月龄Wt小鼠脑组织Aβ发现，并联后脑Aβ水平随并联时间延长而逐渐增高。
　　2.并联Wt小鼠脑内出现Aβ斑块和CAA。并联2月、4月和8月Wt小鼠脑内无明显Aβ沉积，但是，不同染色方法均观察到Aβ沉积于并联12月Wt小鼠的血管壁形成脑淀粉样血管病(Cerebral amyloid agiopathy，CAA)，还可观察到外周Aβ沉积于脑实质形成小的Aβ斑块。另外，免疫组化染色还在并联12月Wt小鼠的皮层部分区域观察到胞浆染色阳性的神经细胞，表明外周血Aβ不仅沉积于脑血管壁及附近脑实质，而且可进入神经细胞并积聚。
　　3.并联Wt小鼠脑内出现的其它AD类型改变。并联Wt小鼠脑内pS199和pS396水平增加，表明tau磷酸化加重。既往研究发现Aβ可诱导变性p75NTR神经纤维。在对照组Wt小鼠脑内未见变性p75NTR神经纤维，而在并联12月Wt小鼠皮层则观察到明显的变性p75NTR神经纤维。NF200也是一种神经损伤标记物。对照组Wt小鼠皮层可见致密、较长的NF200阳性神经纤维，而并联12月Wt小鼠皮层的NF200阳性神经纤维较稀疏，且NF200在胞浆大量积聚。为了研究并联是否加剧Wt小鼠脑内神经炎症反应，我们检测了并联Wt小鼠和对照Wt小鼠脑匀浆中几种常见炎症因子水平，发现并联12月Wt小鼠脑内TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平均明显升高。而且，并联Wt小鼠脑内CAA和Aβ斑块周围聚集大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞，进一步表明外周血Aβ进入脑内沉积后加剧神经炎症。另外，与对照组Wt小鼠相比，并联12月Wt小鼠脑微出血明显严重，血脑屏障上的Aβ转运体LRP1水平降低，而RAGE水平显著增高。
　　研究二、常见病原体慢性感染与AD的相关性研究
　　与对照组相比，AD组中血清病原体抗体阳性数高的人群比例较高。校正各种危险因素后，AD组总感染负荷、细菌负荷和病毒负荷均明显高于对照组，且感染负荷越高，患AD的相对危险度越高，表明感染负荷是AD的独立危险因素。而且，感染负荷越高，血液中Aβ和炎症因子水平越高。
　　研究三、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究
　　OSAS患者血清Aβ和P-tau181水平显著高于正常对照组。校正年龄、性别、受教育水平、吸烟史、体重指数等后，血清Aβ与衡量疾病严重程度的指标AHI呈正相关，与缺氧指标如MSaO2和ODI也显著相关。
　　研究四、慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究
　　COPD患者血清Aβ水平显著高于正常对照组。血清CRP、IL-6和PCT水平超过正常值的COPD患者的血清Aβ水平更高。而且，COPD患者的血清Aβ水平与疾病严重程度相关，肺功能越差，血清Aβ水平越高。
　　讨论：
　　研究一、外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用
　　无论是6E10、4G8、刚过红还是硫磺素S染色，均在并联12月Wt小鼠皮层血管壁观察到CAA，而且还在脑实质观察到小的Aβ斑块。另外，在并联12月Wt小鼠脑内观察到明显的tau异常磷酸化、神经变性、神经炎症和微出血，表明外周血Aβ进入Wt小鼠脑内并形成典型的AD类型病理改变。
　　由于以Aβ为AD治疗靶点的临床试验未成功，Aβ级联假说目前受到质疑。AD模式动物由于过表达人AβPP基因而产生大量Aβ，导致神经元丢失和认知减退。但是，对于占AD人群绝大多数的散发性AD患者，其AβPP基因的表达水平与正常人并无差异，脑内Aβ过度积聚的主要原因是Aβ清除能力下降。本研究中，不表达人AβPP基因的小鼠暴露于外源性Aβ12月后，脑内即出现典型AD类型病理改变，该结果进一步证实了Aβ级联假说，表明Aβ是AD的核心致病物质。
　　AβPP表达于中枢和外周组织，经蛋白酶切后生成Aβ。血液Aβ的来源包括脑和外周组织器官。血小板表达AβPP，被认为是Aβ的最大外周来源，而且MCI和AD患者的血小板膜上BACE1活性较正常人分别增加约24％和17％。早期研究发现，AD患者的皮肤成纤维细胞较正常人可分泌更多Aβ。AD患者的颞肌中Aβ水平也较正常人高。流行病学调查发现骨质疏松症患者的AD罹患风险较高。另有研究表明骨细胞可产生Aβ，且其在骨质疏松组织中的含量更高。因此，AβPP代谢紊乱可能是AD患者的一个全身性问题。但是，外周产生的Aβ能否进入脑内并沉积仍不清楚。本研究首次发现外周Aβ可进入Wt小鼠脑内诱导出AD类型病理改变。而且，Wt小鼠至少与AD小鼠并联12月后才会形成AD类型病理改变。因此，Wt小鼠诱导出AD类型病理改变的两个关键条件是获得人源性Aβ且时间足够长，我们推测这可能与散发型AD需要数十年的发病过程有关。
　　目前研究者普遍认为脑内Aβ是AD发生的关键原因，而外周循环中的Aβ对脑AD类型病理改变的影响还不清楚。Wt小鼠通过与AD小鼠并联获得的外源性Aβ可沉积于脑血管壁、脑实质以及神经细胞，提示外周细胞产生的Aβ可能参与脑淀粉样变，AD很可能是一个全身系统性疾病。
　　研究二、常见病原体慢性感染与AD的相关性研究
　　本研究发现感染负荷与AD相关，但是机制不明。这种相关性可能归结于AD患者更易感染病原体。但有研究表明，接种病原体疫苗可一定程度上预防AD发生。所以，这种相关性也可能是慢性感染促进了AD发生。另外，感染负荷可促进心脑血管疾病发生，而这些疾病是AD的危险因素。所以，感染负荷也可能通过增加心脑血管疾病风险而间接促进AD发生发展。
　　本项研究中，感染负荷高的人群的外周血炎症因子水平较高，表明感染可能通过炎症途径增加AD罹患风险。AD患者体内存在大量针对Aβ的自身抗体，所以AD也被认为是一种自身免疫性疾病。但是，这些自身抗体的来源并不清楚。蛋白序列比对发现，多种病原体表达与人AβPP和Aβ相似的氨基酸序列。因此，感染也可能通过激活自身免疫系统产生大量自身抗体，对脑内神经元形成免疫攻击。感染负荷越高的人群的外周血Aβ水平越高，这是本研究的一项重要发现，它有助于我们理解感染负荷和AD的相关性，感染负荷可能通过增加Aβ水平促进AD发生。
　　本研究证实常见病原体感染与Aβ代谢和AD患病风险相关，为AD的感染和炎症学说提供重要依据，也从另一方面说明AD是全身系统性疾病。
　　研究三、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究
　　Aβ水平在中枢和外周是一个动态平衡，血清高Aβ水平可能代表脑内高Aβ负荷，因此，本研究与既往关于缺氧增加脑内Aβ的研究结论一致。另一方面，血清中升高的Aβ也可能来自外周表达AβPP和β-分泌梅的器官和组织。血清中磷酸化tau蛋白可作为反映神经损伤的生化标志物。本研究中，OSAS患者血清磷酸化tau蛋白水平显著升高，且与Aβ水平成正相关。因此，本研究观察到的OSAS患者血清磷酸化tau蛋白升高应该是缺氧所致。
　　这是一个横断面研究，因此我们无法确定OSAS和Aβ的因果关系。近期研究发现持续性正压通气治疗可降低OSAS患者认知功能减退速度，而这可能得益于对缺氧的改善。但是，纠正缺氧是否能降低Aβ和磷酸化tau蛋白水平值得继续研究。
　　总的来说，本研究发现OSAS患者血清Aβ升高，且与缺氧严重程度成正相关。该研究结果表明OSAS可能促进AD相关病理改变，提示AD是全身系统性疾病。OSAS是中老年人中的常见病，及时治疗该病或许能够在一定能够程度上预防AD的发生发展。
　　研究四、慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究
　　此研究表明COPD促进AD相关病理生理过程发展。众所周知，呼吸道感染和炎症反应是COPD的重要特征。炎症在AD发病中起到重要作用。血清PCT水平是COPD伴有细菌感染的重要标志物。本研究发现血清PCT水平高的COPD患者的Aβ水平较高，表明感染和炎症可增加COPD患者Aβ水平。本研究中，COPD较严重即肺功能较好的COPD患者的血清Aβ水平较高，也说明缺氧可能是COPD患者血清Aβ水平增高的原因之一。
　　本研究发现认知功能正常的COPD患者血清Aβ升高，或表明其已发生AD相关病理改变。该研究结果与目前COPD增加AD患病风险的流行病学调查一致。但是，这是一项横断面研究，期待未来纵向研究确定COPD患者血清Aβ升高在预测其AD患病风险中的作用。如果该假设得到验证，对COPD患者进行早期干预将有助于预防AD发生。
　　结论：Wt小鼠通过与AD小鼠并联获得的外源性Aβ可进入脑内形成CAA和Aβ斑块，表明外周Aβ可参与脑淀粉样变，提示AD很可能是一个全身系统性疾病。感染、OSAS、COPD与血液AD生物标志物具有相关性，进一步说明全身疾病可能影响Aβ代谢和AD发生。我们的研究结果有助于从全身角度理解AD的发病机制以及建立有效防治方法。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 常见病原体慢性感染与AD的相关性研究

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

5．4 讨论

全文结论

今后研究方向

参考文献

文献综述一

文献综述二

攻读博士学位期间的研究成果

致谢